Agar EMB versus agar MacConkey: selectarea și interpretarea mediilor

Un student însămânțează prin striere aceeași probă de apă pe două plăci. Pe una apar colonii închise la culoare, cu un luciu metalic verde. Pe cealaltă apar colonii roz intens, cu un halou difuz. Ambele plăci au fost inoculate din același tub, incubate una lângă alta și citite la aceeași oră. Studentul întreabă care placă este corectă.

Ambele plăci sunt corecte. Ele răspund la întrebări diferite. Confuzia apare atunci când cele două medii sunt tratate ca teste de screening interschimbabile pentru bacteriile intestinale. Au un scop comun, acela de a selecta organisme enterice Gram-negative și de a separa fermentatorii de lactoză de nefermentatori, dar ating acest scop prin chimii diferite și prin logici vizuale diferite. Odată înțelese cele două concepte de bază, selectarea plăcii și citirea coloniilor devin proceduri de rutină.

Răspunsul pe scurt

Agarul EMB utilizează doi coloranți, eozină Y și albastru de metilen, care îndeplinesc două funcții: inhibă creșterea organismelor Gram-pozitive și precipită în jurul producătorilor puternici de acid, formând colonii închise la culoare, în mod clasic cu un luciu metalic verde în cazul Escherichia coli. Agarul MacConkey separă aceste funcții: sărurile biliare împreună cu cristal violet inhibă organismele Gram-pozitive, lactoza permite fermentarea, iar roșul neutru indică acidul prin colonii roz sau roșii. Dacă obiectivul este o demonstrație prezumtivă vizibilă a E. coli, EMB își justifică utilizarea. Dacă obiectivul este o separare clară între fermentatorii de lactoză roz și nefermentatorii incolori, în special în fluxurile de lucru pentru materii fecale sau urină, MacConkey oferă de obicei o citire mai simplă. Niciuna dintre plăci nu identifică un organism doar pe baza culorii.

EMB: coloranți care selectează și indică simultan

Conceptul EMB integrează selecția și indicarea în aceleași molecule. Protocolul ASM pentru agar cu eozină și albastru de metilen descrie EMB ca fiind atât selectiv, cât și diferențial, perechea de coloranți inhibând numeroase organisme Gram-pozitive, în timp ce fermentarea lactozei determină absorbția și precipitarea coloranților. O formulă Levine standard conține peptonă, lactoză, fosfat, eozină Y, albastru de metilen și agar, așa cum este specificat în metoda FDA BAM pentru agar Levine EMB. Rețineți că unele rețete EMB mai vechi adăugau zaharoză împreună cu lactoza, în timp ce Levine EMB conține lactoză fără zaharoză, așadar înregistrați formula pe care o are în stoc laboratorul dumneavoastră.

Citirea EMB înseamnă interpretarea comportamentului coloranților. Fermentarea intensă a lactozei produce suficient acid pentru a provoca o precipitare puternică a coloranților, conferind E. coli centre de culoare albastru-negru închis și, în cazul clasic, un luciu metalic verde în lumină reflectată. Fermentatorii mai slabi, precum Enterobacter și Klebsiella, cresc de obicei sub formă de colonii mucoide roz până la violet, fără acest luciu. Nefermentatorii precum Salmonella, Shigella și Proteus cresc în general sub formă de colonii incolore sau translucide, deoarece nu produc creșterea bruscă a acidității care determină precipitarea coloranților. Organismele Gram-pozitive sunt de obicei inhibate, deși gradul de inhibare variază în funcție de tulpină și produs. Chimia completă a preparării coloranților, inclusiv motivul pentru care albastrul de metilen se comportă în primul rând ca un colorant cationic, aparține unei discuții separate despre formulările coloranților, iar contextul general al microscopiei este prezentat într-un atlas al metodelor de colorare. Acest articol se concentrează pe selectarea și citirea plăcilor.

Figura de mai sus este ilustrativă. Ea prezintă logica vizuală de așteptat: colonii închise la culoare cu luciu, tipuri mucoide roz și tipuri palide pe EMB, comparativ cu tipuri roz versus palide pe MacConkey. Folosiți-o pentru a învăța tiparul, apoi confirmați fiecare interpretare folosind controale fotografiate și prospectul produsului pentru mediul exact aflat pe masa de lucru.

MacConkey: funcții separate, regulă vizuală mai simplă

Conceptul MacConkey atribuie fiecare funcție unui ingredient separat. Protocolul ASM pentru agar MacConkey utilizează aceeași clasificare selectivă și diferențială, iar metoda FDA BAM pentru agar MacConkey enumeră componentele active: peptone, lactoză, săruri biliare, sare, roșu neutru, cristal violet și agar. Sărurile biliare împreună cu cristal violet selectează împotriva organismelor Gram-pozitive. Lactoza furnizează substratul pentru fermentare. Roșul neutru funcționează ca indicator de pH, devenind roz până la roșu acolo unde se formează acid, uneori cu bilă precipitată în jurul fermentatorilor puternici.

Regula de citire este intenționat simplă: roz înseamnă fermentator de lactoză, iar incolor sau pal înseamnă nefermentator. E. coli apare roz până la roșu, adesea cu un halou de precipitat biliar. Klebsiella și Enterobacter apar roz și frecvent mucoide din cauza capsulelor lor. Salmonella, Shigella, Proteus și numeroși alți bacili Gram-negativi apar incolori. Un avantaj suplimentar este important în laboratoarele didactice: sărurile biliare reduc în general fenomenul de swarming al Proteus, astfel încât coloniile izolate sunt mai ușor de obținut pe MacConkey decât pe medii neselective, deși inhibarea nu este absolută și există alternative fără sare atunci când controlul swarmingului este prioritar.

Explicația moleculară a comportamentului acestor coloranți ține de sarcină și structură. Albastrul de metilen este un colorant fenotiazinic cationic ale cărui structură și proprietăți explică afinitatea pentru suprafețele bacteriene acide, aceeași afinitate care intervine atunci când precipită în zonele acide de pe EMB.

Comparație dintr-o privire

Citiți tabelul ca pe o procedură de decizie. Atunci când exercițiul cere studenților să observe un gradient al intensității fermentării cu un punct final spectaculos, EMB îl evidențiază. Atunci când exercițiul cere o separare binară rapidă înaintea confirmării biochimice, MacConkey o evidențiază.

Ce mediu pentru ce probă

Pentru exercițiile cu apă orientate spre recunoașterea prezumtivă a coliformilor fecali sau a E. coli, EMB este atractiv deoarece luciul este distinct din punct de vedere vizual. MacConkey permite de asemenea cultivarea bacteriilor enterice Gram-negative și a fost utilizat istoric pentru analiza apei, dar niciuna dintre plăci nu înlocuiește o metodă de reglementare pentru analiza apei, care poate specifica medii precum mTEC modificat sau MI, în funcție de test. Verificați metoda pe care laboratorul dumneavoastră este obligat să o urmeze.

Pentru separările de tipul celor efectuate pe materii fecale între fermentatori și nefermentatori, MacConkey este în general mai util dintre cele două. Activitatea practică pe probe fecale pentru Salmonella sau Shigella include în mod normal medii enterice mai selective, precum XLD sau Hektoen enteric, în loc să se bazeze exclusiv pe MacConkey.

Pentru exercițiile didactice pe urină care imită fluxul de lucru clinic, combinați MacConkey cu agar sânge. MacConkey oferă separarea inițială a organismelor Gram-negative, în timp ce agarul sânge permite recuperarea organismelor pe care MacConkey le inhibă. Această asociere este standard în descrierile clinice ale configurării culturilor de urină.

Pentru predarea conceptelor în formă pură, utilizați-le pe ambele. EMB arată că intensitatea fermentării contează și că o singură moleculă poate îndeplini două roluri. MacConkey arată proiectarea modulară: selectorul, substratul și indicatorul sunt menținute separat. Studenții care însămânțează prin striere, una lângă alta, o tulpină cunoscută de E. coli, una cunoscută de Klebsiella aerogenes și una cunoscută de Salmonella pe ambele medii rareori mai confundă ulterior cele două logici.

Capcane de interpretare care se repetă în fiecare semestru

Cea mai frecventă eroare este identificarea numai pe baza culorii. Roz pe MacConkey poate însemna E. coli, Klebsiella, Enterobacter sau un alt fermentator. Incolor poate însemna Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas sau un alt nefermentator. Culoarea este un fenotip de screening care orientează investigațiile de confirmare, precum colorația Gram, oxidaza, panourile biochimice sau identificarea instrumentală, nu un nume de specie.

A doua eroare este interpretarea excesivă a absenței luciului. Unele colonii autentice de E. coli, în special cele izolate, produc puțin luciu metalic sau deloc pe EMB. Absența luciului nu exclude E. coli, iar prezența luciului nu o dovedește. Tratați luciul drept un indiciu prezumtiv.

A treia eroare este compararea plăcilor de vârste diferite. Fermentatorii tardivi ai lactozei pot deveni roz pe MacConkey după incubare prelungită, ceea ce estompează separarea clară dintre fermentatori și nefermentatori. Citiți rezultatul la ora specificată de laborator și înregistrați timpul de incubare împreună cu rezultatul.

A patra eroare este interpretarea unei creșteri mixte ca fiind un singur organism. O colonie roz lângă o colonie incoloră reprezintă două fenotipuri, nu unul intermediar. Selectați colonii bine izolate și analizați separat fiecare morfotip. Textura mucoidă creează o capcană similară: atât Klebsiella, cât și Enterobacter pot avea aspect mucoid, astfel încât capsula singură nu stabilește niciodată identificarea. Organismul predat anterior sub denumirea Enterobacter aerogenes este acum clasificat drept Klebsiella aerogenes, ceea ce explică de ce tabelele mai vechi și etichetele mai noi par să se contrazică.

Controale și o regulă finală

Utilizați la fiecare sesiune controale fotografiate sau proaspete: E. coli pentru reacția fermentatorului puternic, Klebsiella aerogenes pentru fermentarea mucoidă fără luciul clasic, o tulpină de Salmonella pentru reacția incoloră a nefermentatorului și Staphylococcus aureus pentru a confirma inhibarea organismelor Gram-pozitive pe produsul exact utilizat. Corelați numerele tulpinilor și criteriile de acceptare cu prospectul producătorului, deoarece selectivitatea variază în funcție de conținutul de bilă, cristal violet și coloranți.

Rețineți o singură propoziție la masa de lucru. EMB folosește coloranți care atât selectează, cât și indică, oferind un semnal spectaculos pentru E. coli în schimbul unei citiri mai subtile. MacConkey separă selecția de indicare, oferind o separare simplă între roz și pal în schimbul unui nivel mai redus de detaliu privind fermentarea. Alegeți mediul al cărui concept corespunde întrebării, confirmați culoarea prin teste adecvate, iar cele două plăci încetează să concureze și încep să se completeze.