Nowy błękit metylenowy i barwienie retikulocytów: odrębny barwnik i metoda barwienia żywych komórek

Student przygotowuje się do zliczania retikulocytów, zamawia błękit metylenowy, miesza go z krwią i prawie nic nie widzi. Kolega używa butelki oznaczonej jako nowy błękit metylenowy i uzyskuje wyraźne niebieskie włókienka wewnątrz części krwinek czerwonych. Pierwszy student zakłada, że zawartość drugiej butelki jest świeższa albo bardziej stężona. Ani jedno, ani drugie. Zawiera inną cząsteczkę.

To właśnie ten błąd pojęciowy odpowiada za większość nieporozumień w tej dziedzinie. Nazwa sugeruje, że nowy błękit metylenowy jest ulepszoną partią błękitu metylenowego. Chemia mówi co innego. Nowy błękit metylenowy N to odrębny barwnik fenotiazynowy, z własnym numerem Colour Index, własnym układem podstawników i własną, znormalizowaną rolą w hematologii. Gdy ta różnica jest jasna, łatwiej zrozumieć resztę metody: dlaczego podczas barwienia komórki muszą być żywe, co uznaje się za retikulocyt, jakie miejsce zajmują ciałka Heinza i kiedy pojawia się brylantowy błękit krezylowy.

Krótka odpowiedź

Nowy błękit metylenowy N, odczynnik hematologiczny, jest zazwyczaj identyfikowany jako Basic Blue 24 we wpisie PubChem dotyczącym nowego błękitu metylenowego, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, o wzorze C18H22ClN3S. Zwykły błękit metylenowy to chlorek metylotioniniowy, Basic Blue 9, we wpisie PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, o wzorze C16H18ClN3S. Pod względem struktury nowy błękit metylenowy ma dwie grupy metylowe przy pierścieniu oraz boczne grupy etyloaminowe tam, gdzie błękit metylenowy ma grupy dimetyloaminowe. Ta różnica zmienia właściwości barwiące. Podręczniki hematologii opisują zwykły błękit metylenowy jako stosunkowo słaby barwnik retikulocytów, a nowy błękit metylenowy jako dający intensywniejsze i bardziej równomierne barwienie. Porównanie to podsumowano w omówieniu nowego błękitu metylenowego w ScienceDirect.

Tak, nowy błękit metylenowy jest barwnikiem przyżyciowym. Barwienie przyżyciowe oznacza barwienie żywych komórek po pobraniu ich z organizmu, a przed utrwaleniem, zgodnie z definicją w przeglądzie zasad barwienia przyżyciowego w NCBI. Do tej kategorii należą zarówno nowy błękit metylenowy, jak i brylantowy błękit krezylowy, a norma CLSI dotycząca retikulocytów wyraźnie uwzględnia nowy błękit metylenowy jako barwnik przyżyciowy. Studenci czasem zaliczają tę metodę do barwienia utrwalonych rozmazów metodą Romanowskiego. Ten sposób myślenia tutaj zawodzi. Jeśli najpierw utrwalisz komórki, metoda przestanie działać.

Dla czytelników porównujących podobne nazwy barwników artykuł błękit metylowy a błękit metylenowy omawia inne, szersze nieporozumienie: mylenie anionowego barwnika triarylometanowego z kationową rodziną fenotiazynową. Przegląd barwienia laboratoryjnego przedstawia barwienie przyżyciowe obok metod stosowanych do utrwalonych rozmazów, a przewodnik po morfologii komórek krwi pokazuje miejsce oceny retikulocytów w szerszej ocenie różnicowej.

Jedna uwaga dotycząca katalogów: istnieje odrębna postać nowego błękitu metylenowego jako soli podwójnej z chlorkiem cynku, oznaczona numerem CAS 6586-05-6. Dlatego w opisie metod należy podać postać soli i dostawcę, a nie tylko nazwę zwyczajową.

Co faktycznie robi barwienie przyżyciowe

Retikulocyt to młoda krwinka czerwona, która utraciła jądro, ale zachowała resztkowy rybosomalny RNA. W niebarwionym preparacie mokrym ten RNA jest niewidoczny. Barwnik przyżyciowy wnika do żywej komórki i powoduje wytrącanie lub agregację RNA w niebieskie ziarnistości i włókienka, czyli materiał siateczkowo-włóknisty widoczny przy użyciu immersji olejowej. Siateczka jest więc produktem barwienia, a nie gotowym szkieletem czekającym na nadanie koloru. Dlatego zmienne protokołu — stężenie barwnika, bufor, stosunek krwi do barwnika, temperatura i czas — mają równie duże znaczenie jak nazwa barwnika.

Praktyczną konsekwencją jest ścisła kolejność czynności: najpierw zmieszaj krew pobraną na antykoagulant z barwnikiem, inkubuj, a następnie wykonaj rozmazy i oceń je bez utrwalania oraz bez barwienia kontrastowego. Utrwalenie przed barwieniem lub barwienie kontrastowe zasłaniające słabo widoczne włókienka niszczy informację, na której opiera się zliczanie.

Praktyczny protokół barwienia retikulocytów nowym błękitem metylenowym

Nie istnieje jeden uniwersalny skład roztworu, dlatego należy podać skład faktycznie użyty. Trzy udokumentowane warianty pokazują zakres możliwości.

Klasyczna procedura typu Brechera wykorzystuje około 0.5 procent nowego błękitu metylenowego ze szczawianem potasu. Roztwór miesza się w równych objętościach z dokładnie wymieszaną krwią pobraną na EDTA i inkubuje przez około 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Po ponownym delikatnym wymieszaniu wykonuje się cienkie rozmazy klinowe, suszy je na powietrzu i ocenia bez utrwalania pod obiektywem immersyjnym 100x. Procedura zliczania retikulocytów w NCBI opisuje ten tok postępowania oraz stosowane w nim pole zliczania.

Wariant Dacie i Lewisa wykorzystuje 1.0 procent nowego błękitu metylenowego w roztworze soli z cytrynianem, mieszanego z 2 do 4 objętościami krwi i przetrzymywanego w 37 C przez 15 do 20 minut przed wykonaniem rozmazów. W niedawnym wdrożeniu harmonizacyjnym procedury CLSI H44 zastosowano mniej stężony roztwór 0.1 procent w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7.4, z inkubacją w 20 C przez 10 minut i bez utrwalania, jak opisano w badaniu harmonizacji NMB z 2026 roku.

Zasady zliczania są wspólne dla wszystkich wariantów. Komórkę uznaje się za retikulocyt, gdy zawiera co najmniej dwie odrębne, niebiesko wybarwione ziarnistości lub odcinki włókienek, co pozwala wykluczyć pojedynczy osad barwnika. W rutynowej pracy należy zliczyć co najmniej 1,000 krwinek czerwonych i podać retikulocyty jako odsetek. Przy niskich odsetkach statystyka wymaga zliczenia większej liczby komórek. W przeglądzie metodologii CLSI H44 wskazano, że przy odsetku retikulocytów bliskim 1 procent potrzeba około 4,400 komórek, aby zmniejszyć zmienność zliczania do 5 procent; opisano to w przeglądzie CLSI H44 w De Gruyter. Siatka okularowa Millera ułatwia zliczanie dużej liczby komórek. Barwnik należy filtrować lub przygotowywać na świeżo, ponieważ osad naśladuje ziarniste wtręty.

Ciałka Heinza w tym samym preparacie

Ten sam rozmaz barwiony przyżyciowo może również uwidocznić ciałka Heinza, które są agregatami utlenionej i zdenaturowanej hemoglobiny, a nie resztkowym RNA. W preparatach z nowym błękitem metylenowym mają postać okrągłych ciałek, często pojedynczych i położonych blisko błony komórkowej, wybarwionych na jaśniejszy niebieski kolor niż materiał siateczkowo-włóknisty. Słabo zachowują się podczas utrwalania i barwienia kontrastowego, dlatego należy oceniać nieutrwalony rozmaz. W niedawnym protokole, wykorzystującym 20 mikrolitrów krwi pobranej na EDTA, 20 mikrolitrów 1-procentowego nowego błękitu metylenowego i 15 minut inkubacji, określano liczbę komórek z ciałkami Heinza wśród 250 erytrocytów; procedurę opisano w badaniu dostępnym w PMC.

Dwa rozróżnienia pomagają uniknąć błędnej interpretacji. Po pierwsze, fiolet metylowy i fiolet krystaliczny barwią ciałka Heinza intensywniej niż nowy błękit metylenowy, jak zaznaczono w omówieniu ciałek Heinza w ScienceDirect. Nowy błękit metylenowy jest wygodnym wyborem przy jednoczesnej ocenie retikulocytów i ciałek Heinza, ale nie jest najsilniejszym barwnikiem przeznaczonym specjalnie do ciałek Heinza. Po drugie, wtręty HbH przy nosicielstwie alfa-talasemii po barwieniu przyżyciowym tworzą liczne drobne punkty w całej komórce, podczas gdy klasyczne ciałka Heinza są mniej liczne, większe i często związane z błoną komórkową. Trzecim źródłem podobnego obrazu jest osad barwnika: znajduje się poza płaszczyzną ostrości komórek i różni się między polami widzenia.

Brylantowy błękit krezylowy a nowy błękit metylenowy

Oba barwniki służą do przyżyciowego barwienia retikulocytów, ale standaryzacja preferuje jeden z nich. Metoda oznaczania retikulocytów CLSI H44-A2, opracowana wspólnie z Międzynarodową Radą ds. Standaryzacji w Hematologii i przedstawiona na stronie normy CLSI H44, wskazuje barwienie krwi pobranej na EDTA nowym błękitem metylenowym jako ręczną metodę porównawczą. Klasyczne podręczniki hematologii są zgodne co do obrazu: nowy błękit metylenowy daje intensywniejsze i bardziej równomierne barwienie włókienek, natomiast brylantowy błękit krezylowy wykazuje większą zmienność między partiami i próbkami.

Ten status wymaga jednak zastrzeżenia. Wytyczne ICSH dotyczące oceny analizatorów dopuszczają ręczną ocenę mikroskopową z użyciem nowego błękitu metylenowego jako referencyjne podejście porównawcze, ale określają ją jako subiektywną i stosunkowo mało precyzyjną, preferując referencyjne procedury cytometrii przepływowej tam, gdzie są dostępne. Porównanie 100 próbek z 2022 roku wykazało mniejsze odchylenie względem wyników użytego analizatora przy zastosowaniu brylantowego błękitu krezylowego niż nowego błękitu metylenowego; opisano to w porównaniu metod barwienia dostępnym w PMC. Rzetelne podsumowanie dla studentów brzmi: stosuj nowy błękit metylenowy jako znormalizowany odczynnik porównawczy w metodzie ręcznej, weryfikuj każdą lokalną metodę z brylantowym błękitem krezylowym względem tej metody lub metody automatycznej i w obu przypadkach spodziewaj się większego rozrzutu wyników ręcznej mikroskopii. Starsza literatura dotycząca standaryzacji również zalecała oczyszczony Azure B jako chemicznie czystszą alternatywę, ponieważ partie barwników dostępnych handlowo różniły się między sobą; omówiono to w badaniu Marshalla dotyczącym Azure B. Wyjaśnia to, dlaczego stopień czystości odczynnika nadal pojawia się w dyskusjach o metodach.

Jak unikać typowych błędów

Cztery błędy odpowiadają za większość nieudanych preparatów. Zamówienie zwykłego błękitu metylenowego zamiast nowego błękitu metylenowego N prowadzi do słabego barwienia z przyczyn chemicznych, a nie technicznych. Utrwalanie lub barwienie kontrastowe przed oceną usuwa sygnał barwienia przyżyciowego. Zliczanie osadu barwnika jako ziarnistości zawyża wynik, czemu zapobiegają zasada dwóch ziarnistości i filtrowanie barwnika. Zliczanie zbyt małej liczby komórek przy niskim odsetku retikulocytów daje pozornie precyzyjną liczbę z szerokimi granicami ufności. Każdy z tych błędów ma ten sam charakterystyczny objaw: osoba wykonująca ocenę mikroskopową obwinia mikroskop za to, o czym przesądził etap pracy z odczynnikiem.