Błękit metylenowy a neuroprzekaźniki: serotonina, dopamina, GABA i acetylocholina

Często powtarza się, że błękit metylenowy jednocześnie podnosi poziom serotoniny i dopaminy, uspokaja układ GABA i wyostrza działanie acetylocholiny. Takie zdanie traktuje cztery odrębne wyniki laboratoryjne jak jeden efekt zachodzący w organizmie człowieka. Badania, na których się opiera, dotyczyły różnych celów molekularnych, w różnych preparatach, przy stężeniach różniących się mniej więcej tysiąckrotnie. Po rozdzieleniu tych celów obraz staje się zarówno ciekawszy, jak i wymagający większej ostrożności, niż sugeruje to jedno zdanie.

Zasada porządkująca jest prosta. Cząsteczka, która wiąże enzym w probówce, zrobiła jedną rzecz: związała enzym w probówce. To, czy zmieni przez to poziom neuroprzekaźnika w żywym mózgu, zależy od stężenia docierającego do tkanki, postaci chemicznej cząsteczki w chwili dotarcia oraz wszystkich innych działań tej cząsteczki przy tym samym stężeniu. W każdej poniższej sekcji te trzy pytania pozostają powiązane z wynikiem, którego dotyczą.

Serotonina: dwa cele, dwa stężenia

Spośród czterech układów to dla serotoniny dowody są najmocniejsze. Dotyczą jednak dwóch odrębnych celów molekularnych, których nie należy łączyć.

Pierwszym celem jest monoaminooksydaza typu A, mitochondrialny enzym rozkładający serotoninę. Błękit metylenowy silnie wiąże oczyszczoną ludzką MAO-A i hamuje ją przy Ki wynoszącej około 27 nanomoli na litr, natomiast wpływ na MAO-B wymaga znacznie wyższych stężeń, jak wykazano w badaniu kinetycznym, które powiązało barwnik z toksycznością serotoninową. W powiązanych badaniach stwierdzono tę samą selektywność w tkance szyszynki szczura: blokada MAO-A zwiększała ilość indoli pochodzących z serotoniny, obniżała poziom jej metabolitu 5-HIAA i zmieniała związany z serotoniną odruch prostowania u żab. Opisano to w badaniu barwników redoks i indoli szyszynkowych. Dwa różne preparaty, ten sam kierunek: mniej rozkładu, więcej serotoniny pozostającej tam, skąd enzym by ją usunął.

Drugim celem jest sam transporter serotoniny. W komórkach wykazujących ekspresję ludzkiego transportera błękit metylenowy ograniczał wychwyt zarówno fluorescencyjnego substratu, jak i znakowanej serotoniny przy IC50 wynoszącym około 1.4 mikromola na litr. Tłumił też prądy wywoływane przez serotoninę w pomiarach metodą patch-clamp, zgodnie z bezpośrednią charakterystyką działania błękitu metylenowego na SERT. Autorzy sprawdzili oczywiste alternatywne wyjaśnienia i stwierdzili, że efekt był niezależny od sygnalizacji cGMP, zmian stężenia wapnia oraz ekspresji transportera na powierzchni komórek.

Warto zwrócić uwagę na różnicę między tymi dwiema wartościami. Hamowanie MAO-A zachodzi przy stężeniach nanomolowych. Hamowanie transportera wymaga około pięćdziesięciokrotnie większej ilości barwnika. Niska ekspozycja, która w pełni oddziałuje na enzym, może mieć znikomy wpływ na transporter. Łączenie tych wyników w jedno twierdzenie o serotoninie oznacza uśrednianie dwóch różnych zakresów dawek.

To, czy którykolwiek z tych celów ma znaczenie u osoby przyjmującej inne leki serotoninergiczne, jest kwestią dotyczącą leków i należy do poradnika interakcji lekowych. Ten artykuł przedstawia mapę celów molekularnych; tamta strona zawiera wskazówki kliniczne.

Dopamina: najsłabsze dowody bezpośrednie

W przypadku dopaminy rzetelność wymaga największej powściągliwości. Nie ma solidnie potwierdzonego badania wykazującego, że błękit metylenowy blokuje transporter dopaminy lub bezpośrednio wiąże jej receptory. Często cytowana wartość IC50 transportera wynosząca 1.4 mikromola na litr dotyczy transportera serotoniny, a nie DAT, i nigdy nie należy przypisywać jej temu drugiemu.

Dostępne dowody są natomiast pośrednie. Ponieważ enzymy MAO metabolizują również dopaminę, hamowanie MAO ogranicza rozkład dopaminy, podobnie jak serotoniny i noradrenaliny. W preparatach mitochondrialnych błękit metylenowy blokował zależne od MAO-B przekształcanie neurotoksyny MPTP w substancję toksyczną dla układu dopaminergicznego z siłą porównywalną do deprenylu, leku stosowanego w chorobie Parkinsona. Opisują to badanie bioaktywacji MPTP i powiązane prace dotyczące MAO-B. Badania na zwierzętach dostarczają fragmentarycznych danych: około trzykrotny wzrost podstawowego uwalniania dopaminy ze skrawków prążkowia szczura przy stężeniu 10 mikromoli na litr, badany w kontekście sygnalizacji tlenku azotu, a nie blokady transportera, oraz niejednoznaczne wyniki w różnych obszarach mózgu po podaniu ogólnoustrojowym. W niektórych badaniach poziomy serotoniny i noradrenaliny rosły, podczas gdy poziom dopaminy zmieniał się nieznacznie.

Związek z dopaminą jest więc rzeczywisty, ale pośredni. Prowadzi przez enzym przetwarzający kilka monoamin jednocześnie, a nie przez cel swoisty dla dopaminy. Każde twierdzenie, że błękit metylenowy podnosi poziom dopaminy u ludzi, pomija etap, na którym należałoby to faktycznie wykazać.

GABA: blokowanie hamulca w kieszeni wiążącej

Wynik dotyczący GABA jest precyzyjny i stoi w sprzeczności z reputacją barwnika. W komórkach wykazujących ekspresję ludzkich receptorów GABA-A błękit metylenowy hamował prądy wywoływane przez GABA już od około 3 mikromoli na litr, z IC50 wynoszącym około 31 mikromoli na litr dla częstej konfiguracji alpha1-beta2-gamma2. Wykazano to w badaniu elektrofizjologicznym określającym miejsce działania.

Najcenniejszą częścią jest ustalenie miejsca działania. Mutacje w miejscu wiązania pikrotoksyny nie zmieniały hamowania, a porównania podjednostek wykluczyły miejsca wiązania benzodiazepin i cynku. Natomiast mutacje dwóch reszt aminokwasowych, o których wiadomo, że tworzą samą kieszeń wiążącą GABA, wyraźnie osłabiały blokadę. Wskazuje to na antagonizm kompetycyjny w miejscu wiązania agonisty, a nie modulację allosteryczną w innym miejscu. Efekt występował przy synaptycznych i pozasynaptycznych kombinacjach podjednostek oraz szybko ustępował po wypłukaniu.

Powstaje tu rzeczywista sprzeczność, którą warto nazwać wprost. Cząsteczka badana pod kątem wspomagania pamięci jednocześnie tłumi szybkie przekaźnictwo hamujące w preparacie laboratoryjnym. To, czy takie tłumienie zachodzi w żywym mózgu, zależy od miejscowego stężenia, a 31 mikromoli na litr to wartość wysoka w porównaniu z większością ekspozycji ogólnoustrojowych, o czym mówi końcowa sekcja. Sama ta sprzeczność jest wynikiem badania; jej rozstrzygnięcie wymagałoby eksperymentów, których nikt dotąd nie przeprowadził.

Acetylocholina: dwa przeciwstawne punkty oddziaływania

W przypadku acetylocholiny mamy dwa wyniki wskazujące na przeciwne kierunki działania — i właśnie dlatego trzeba przedstawiać je oddzielnie.

Z jednej strony błękit metylenowy hamuje enzymy usuwające acetylocholinę. Acetylocholinoesteraza z czerwonych krwinek krowy była hamowana kompetycyjnie przy około 0.57 mikromola na litr, enzym bydlęcy przy około 0.42 mikromola na litr, a aktywność esterazowa ludzkiego osocza przy około 1.1 mikromola na litr. Butyrylocholinoesteraza była hamowana w zakresie około 0.4 do 5.3 mikromola na litr, zależnie od gatunku i preparatu. Zestawiono to w przeglądzie działań błękitu metylenowego w układzie nerwowym. Wolniejsze usuwanie pozostawia więcej neuroprzekaźnika w synapsie — na tej samej zasadzie opiera się działanie kilku zatwierdzonych leków na chorobę Alzheimera.

Istnieje jednak warunek chemiczny. Utleniona, niebieska postać hamuje enzym; zredukowana, bezbarwna postać tego nie robi. Dlatego długie inkubacje, podczas których barwnik ulega redukcji, same w sobie dają wyniki wskazujące na słabsze hamowanie. Każda wartość z oznaczenia aktywności cholinesterazy wiąże się z niewidoczną zmienną: jaka część barwnika nadal była niebieska w chwili pomiaru.

Z drugiej strony błękit metylenowy blokuje nikotynowy receptor alpha7, jeden z receptorów, na które działa acetylocholina. Ludzkie receptory alpha7 eksprymowane w oocytach żaby były hamowane przy IC50 wynoszącym około 3.4 mikromola na litr poprzez niekompetycyjny, niezależny od napięcia antagonizm, który nie zmieniał siły działania agonisty. Z kolei stężenie 3 mikromoli na litr znosiło odpowiedzi synaptyczne wywoływane przez cholinę w skrawkach hipokampa szczura, jak opisuje badanie receptora alpha7. Zatem przy podobnych, niskich stężeniach mikromolowych barwnik zarówno ogranicza usuwanie neuroprzekaźnika, jak i osłabia działanie jednego z jego receptorów. Wypadkowego wpływu na sygnalizację cholinergiczną nie można wywnioskować z żadnego z tych wyników osobno. Ta niejednoznaczność łączy się z szerszą literaturą dotyczącą choroby Alzheimera oraz z powiązanym omówieniem badań nad funkcjami poznawczymi i chorobami, ale nie zostaje tutaj rozstrzygnięta.

Porównanie w jednym miejscu

Najbardziej wrażliwy cel od najmniej wrażliwego dzielą trzy rzędy wielkości. Ten rozrzut to cały artykuł ujęty w jednej tabeli.

Czy te stężenia są osiągane w mózgu?

Wartość z probówki nic nie znaczy bez zestawienia jej z poziomem ekspozycji. Po dożylnym podaniu w bolusie około 1.4 mg na kg odnotowywano u ludzi średnie stężenia w osoczu wynoszące około 5 mikromoli na litr, natomiast doustna dawka 100 mg dawała stężenia we krwi pełnej wynoszące około 0.08 mikromola na litr w tej samej grupie publikacji. Badania dystrybucji u szczurów wskazują na stężenia w mózgu około dziesięć do dwudziestu razy wyższe niż we krwi krążącej. Jest to jednak całkowita ilość barwnika w homogenizowanej tkance, a nie wolny, utleniony barwnik w synapsie. Wiązanie z białkami osocza na poziomie około 94 procent oraz dystrybucja do komórek krwi dodatkowo zmniejszają wolną frakcję.

Na tle tabeli wyłania się obraz stopniowany, a nie zero-jedynkowy. Hamowanie MAO-A zachodzi znacznie poniżej typowych ekspozycji po podaniu dożylnym i jest farmakologicznie prawdopodobne przy podawaniu barwnika tą drogą. Działania na cholinesterazę i alpha7 mieszczą się w zakresie niskich stężeń mikromolowych, który pokrywa się ze szczytowymi stężeniami po podaniu dożylnym, ale może nie być osiągany po zwykłych dawkach doustnych. IC50 dla GABA-A wynoszące 31 mikromoli na litr przewyższa większość prawdopodobnych ekspozycji ogólnoustrojowych, przez co właśnie tę blokadę najtrudniej uznać za zachodzącą w całym organizmie człowieka. Każdy wiersz tego porównania wymaga tego samego zastrzeżenia: znaczenie ma stężenie wolnego, utlenionego barwnika w przestrzeni zewnątrzkomórkowej przy celu działania — wielkość, której żaden pomiar z pobranej krwi nie określa bezpośrednio.

Jakich wniosków nie wyciągać

Żaden wiersz tabeli nie dowodzi, że błękit metylenowy w przewidywalny sposób podnosi lub obniża poziom któregokolwiek neuroprzekaźnika u człowieka. Hamowanie enzymu w oczyszczonym preparacie, blokada transportera w linii komórkowej i antagonizm receptora w skrawku tkanki są wynikami kontrolowanych eksperymentów, z których każdy pozostaje o krok od rzeczywistych warunków w synapsie. Sekcja cholinergiczna pokazuje zaś, jak dwa prawdziwe wyniki o przeciwnych kierunkach pozostawiają niepewność co do efektu końcowego. Odpowiedzialne korzystanie z tej strony polega na traktowaniu jej jako mapy celów, z którymi cząsteczka — jak wykazano — oddziałuje, z oznaczoną siłą tego oddziaływania. Dzięki temu dyskusja o mechanizmach pozostaje oparta na tym, co rzeczywiście zmierzono. Kwestie tego, jak te oddziaływania łączą się z lekami na receptę, omawia poradnik interakcji, a dodatkowego kontekstu dostarczają podstawy farmakologii i powiązane omówienie mechanizmów.