Błękit metylenowy jako wskaźnik warunków beztlenowych i tlenu: czego dowodzi zmiana barwy

Techniczka zamyka szczelnie słój anaerobowy, sprawdza przez pokrywę pasek wskaźnikowy z błękitem metylenowym i widzi to, co chce zobaczyć. Pasek zmienił barwę z niebieskiej na białą. Odnotowuje warunki beztlenowe i przechodzi do kolejnego zadania. Dwa dni później na jednej płytce nie ma wzrostu, a szczelnie zamknięta probówka z bulionem w tym samym słoju wykazuje oznaki kontaktu z tlenem. Pasek mówił prawdę. Zadała mu niewłaściwe pytanie.

Nieporozumienie wynika z pomieszania pojęć. Wskaźnik beztlenowy z błękitem metylenowym opiera się na zjawiskach redoks, a nie na ocenie sterylności ani walidacji całego układu. Gdy to rozróżnienie staje się jasne, pasek okazuje się precyzyjnym i wiarygodnym narzędziem o wąsko określonym zadaniu.

Podstawa działania: odwracalna para redoks

Rozpuszczony błękit metylenowy występuje w dwóch postaciach. Postać utleniona to dobrze znany niebieski kation. Postać zredukowana, zwana leukobłękitem metylenowym, jest bezbarwna. Przy pH zbliżonym do obojętnego uproszczona reakcja połówkowa obejmuje jeden niebieski kation, jeden proton i dwa elektrony, z których powstaje jedna bezbarwna cząsteczka leuko. Potencjał formalny przy pH 7 wynosi około plus 11 miliwoltów względem standardowej elektrody wodorowej. Mieści się więc w zakresie osiągalnym dla wielu układów redukujących, a tlen może odwrócić tę przemianę.

Redukcja wymaga niskiego lokalnego potencjału redoks. Samo usunięcie tlenu nie zawsze wystarcza. We wczesnych badaniach nad warunkami beztlenowymi stwierdzono, że błękit metylenowy w samej wodzie pozbawionej tlenu zachowywał barwę, jeśli nie było w niej substancji redukującej. Mieszaniny bulionu z dekstrozą i około 0.01 procent barwnika łatwo odbarwiały się w temperaturze 37 C, natomiast ta sama mieszanina przechowywana w temperaturze 4 C pozostawała niebieska przez dobę, jak opisano w doświadczeniach dotyczących świeżej tkanki i beztlenowych warunków hodowli. Temperatura, pH, glukoza, askorbinian, tioglikolan i aktywność redukcyjna drobnoustrojów decydują o dostępności elektronów.

Ponowne utlenienie wymaga jedynie tlenu. Gdy powietrze dociera do postaci leuko, ta ponownie staje się niebieska. Współczesne wskaźniki wykorzystują dokładnie ten cykl: barwnik, reduktor i matryca stabilizująca tworzą układ bezbarwny przy niskiej zawartości tlenu, który ponownie staje się niebieski po kontakcie z powietrzem. Wykazano to na przykładzie hybrydowego wskaźnika tlenu z błękitem metylenowym, opartego na barwniku, reduktorze, środku powierzchniowo czynnym i glince. W tym prototypie zastosowano barwnik o stężeniu 0.01 milimola na litr oraz askorbinian lub glukozę o stężeniu 2.0 milimola na litr przy pH 11. Wskaźnik stawał się bezbarwny przy zawartości tlenu około 0.5 procent objętościowych i w komorze testowej pozwalał odróżnić zawartość tlenu poniżej 0.1 procent od zawartości powyżej 0.5 procent.

Zasada działania jest więc prosta. Barwa niebieska oznacza, że strefa wskaźnikowa jest utleniona. Brak barwy oznacza, że w strefie wskaźnikowej osiągnięto warunki redukujące i niską zawartość tlenu. Zmiana jest odwracalna, lokalna i chemiczna. Sama w sobie nie mówi nic o drobnoustrojach.

Jak działa pasek wskaźnikowy z błękitem metylenowym w słoju anaerobowym

Pasek wskaźnikowy z błękitem metylenowym do słoja anaerobowego to niewielka strefa reakcyjna umieszczana w atmosferze słoja tak, aby można było ją obserwować bez otwierania naczynia. Dostępne na rynku formy są różne: paski papierowe, tabletki rozpuszczane lub zwilżane podczas przygotowania oraz nowsze papiery hybrydowe. Niektóre wymagają jednej kropli wody destylowanej do aktywacji strefy reakcyjnej. Inne są wskaźnikami suchymi, które muszą pozostać suche. Decydująca jest instrukcja konkretnego produktu, ponieważ uwodnienie, umiejscowienie i czas odczytu są częścią układu chemicznego.

W praktyce odczyt ma być dwustanowy. Barwa niebieska oznacza, że przy pasku nadal obecny jest tlen lub warunki są niewystarczająco redukujące. Barwa biała lub brak barwy oznacza, że przy pasku ustaliły się beztlenowe warunki redoks. Niektóre dostępne na rynku papiery mają czerwony pigment tła, dlatego ich końcowa barwa po redukcji jest różowa, a nie biała. Zanim ocenisz wskaźnik, sprawdź, jaki stan końcowy deklaruje producent.

Czas zmiany zależy od układu. W jednym układzie typu GasPak odbarwianie rozpoczynało się po około godzinie i kończyło w ciągu kilku godzin, natomiast w kontrolowanym porównaniu w temperaturze pokojowej błękit metylenowy potrzebował ponad sześciu godzin. W tym badaniu potencjał redoks podłoża osiągał około minus 100 miliwoltów w ciągu 60 do 100 minut, znacznie wcześniej niż zakończyła się zmiana barwy. Gdy pasek stawał się całkowicie bezbarwny, potencjał był już znacznie poniżej minus 200 miliwoltów. Wskaźnik reaguje z opóźnieniem względem zmian atmosfery. Niebieski pasek po pierwszej godzinie nie dowodzi niepowodzenia, a biały pasek po szóstej godzinie opisuje stan paska w szóstej godzinie.

Z tego samego powodu ważne jest umiejscowienie. Umieść pasek w przestrzeni gazowej nad podłożami, tak aby był widoczny przez pokrywę, z dala od powierzchni agaru i podłoży hodowlanych. Wskazuje on stan swojego bezpośredniego otoczenia. Jeśli ułożysz go płasko przy zimnej ściance, schowasz pod płytkami albo pozwolisz, by nasiąkł skroplinami, będzie wskazywał warunki tego mikrośrodowiska zamiast warunków w słoju.

Co pasek ujawnia, a czego nie

Traktuj wskaźnik z błękitem metylenowym w słoju anaerobowym jako jeden czujnik w jednym miejscu. Potwierdza lokalne warunki redoks i tlenowe we własnej strefie reakcyjnej, zasadniczo reprezentatywne dla przestrzeni gazowej, jeśli mieszanie i wyrównanie warunków są wystarczające. Wszystko poza tym jest wnioskowaniem, a wnioskowanie wymaga osobnych dowodów.

Bezbarwny pasek nie potwierdza sterylności. Sterylność oznacza brak żywych organizmów i jest potwierdzana przez zwalidowaną sterylizację oraz kontrole walidacyjne hodowli. W słoju mogą panować całkowicie beztlenowe warunki, a mimo to może on być zanieczyszczony. Może też być całkowicie sterylny, a jednocześnie zawierać tlen.

Pasek nie waliduje każdej części układu hodowlanego. Tlen rozpuszczony w szczelnie zamkniętej probówce, tlen uwięziony w głębokich warstwach agaru, gradienty w przepełnionym słoju i nieszczelność powstała po odczycie pozostają poza zasięgiem jednego paska. W doświadczeniach dotyczących rozkładu przestrzennego wykazano sąsiadujące ze sobą strefy niebieskie i bezbarwne w tym samym naczyniu, w których przenikanie tlenu i aktywność redukcyjna równoważyły się w różny sposób. Jeden punkt nie może potwierdzić warunków w całej objętości.

Pasek nie dowodzi też nieprzerwanego utrzymywania się warunków beztlenowych. Jednorazowy odczyt podczas przygotowania nie mówi nic o dwudziestej godzinie. Niedawne prace dotyczące kontroli jakości warunków beztlenowych ostrzegają, że wskaźniki chemiczne opisują atmosferę w chwili odczytu i mogą wyglądać prawidłowo mimo obecności niewielkiej ilości tlenu resztkowego. To ciągła dokumentacja lub zapisy z punktów kontrolnych, a nie pojedyncze spojrzenie na końcową barwę, wiążą odczyt paska z przebiegiem inkubacji.

Chemiczne podstawy zmiany barwy opisano w artykule o tym, jak błękit metylenowy przechodzi między postacią utlenioną a zredukowaną. Szersze omówienie wpływu tlenu na postępowanie z próbkami znajdziesz w materiale o kontroli tlenu w mikroskopii i pracy hodowlanej.

Schemat, który warto mieć obok słoja

Poniższa ilustracja przedstawia najważniejsze informacje z artykułu w formie podręcznej pomocy laboratoryjnej. Pokazuje trzy stany tego samego paska, dwa kierunki reakcji oraz granicę między informacją ze wskaźnika a walidacją układu.

Przyczyny utrzymywania się niebieskiej barwy lub fałszywego poczucia pewności

Większość nieprawidłowości należy do pięciu grup. Każda ma charakterystyczne objawy.

Nieszczelny słój lub worek stale doprowadza tlen do strefy reakcyjnej. Pasek pozostaje niebieski albo ponownie niebieszczeje po odbarwieniu. Zanim uznasz, że zawiodła chemia, sprawdź pokrywę, uszczelkę, zaciski i powierzchnie uszczelniające.

Zużyty lub nieprawidłowo aktywowany generator gazu w ogóle nie usuwa tlenu. W starszych układach aktywowanych wodą brak kondensacji po około 10 do 15 minutach oraz brak ogrzewania się pokrywy po około 20 do 40 minutach były wczesnymi sygnałami ostrzegawczymi dla danego układu. Saszetka o zbyt małej wydajności w przeładowanym słoju zawodzi w ten sam sposób.

Zatrucie katalizatora dotyczy wyłącznie starszych układów wykorzystujących wodór i pallad, w których pallad umożliwia połączenie wodoru i tlenu w wodę. Wilgoć i siarkowodór obniżają jego aktywność. Wiele współczesnych saszetek w ogóle nie wykorzystuje palladu, więc nie stosuj tego rozwiązania tam, gdzie nie ma ono zastosowania.

Zdegradowany lub niewłaściwie używany pasek może zawieść bez wyraźnych oznak. Podczas przechowywania barwnik i reduktor tracą zdolność do odwracalnych przemian. To jeden z powodów opracowania formulacji hybrydowych odpornych na odbarwianie pod wpływem światła i pogorszenie właściwości podczas przechowywania. Odrzuć wskaźniki przeterminowane, o nieprawidłowej barwie początkowej oraz paski zwilżone mimo wymogu użycia na sucho lub pozostawione suche mimo wymogu zwilżenia.

Gradient lub opóźnienie wprowadza w błąd osobę odczytującą wskaźnik, choć sama reakcja chemiczna przebiega prawidłowo. Słabo wymieszana przestrzeń gazowa, szczelnie zamknięte probówki z tlenem rozpuszczonym i podłoża półpłynne zachowują własne warunki dłużej, niż sugeruje pasek. Paski z resazuryną przechodzą przez barwę różową do stanu bezbarwnego i często są reklamowane jako szybsze, lecz ich progi zależą od ich własnej formulacji i nie można przenosić ich na błękit metylenowy.

Kontrole i protokół odczytu, które warto stosować

Dwie niedrogie kontrole pozwalają wykryć większość błędnych odczytów. Obok badanego układu trzymaj świeży pasek kontrolny w powietrzu pomieszczenia. Sprawny pasek z błękitem metylenowym pozostaje tam niebieski. Niektóre zapakowane wskaźniki są początkowo blade i niebieszczeją po otwarciu, co samo w sobie stanowi sprawdzenie działania. Okresowo umieszczaj też świeży pasek w uprzednio zwalidowanym układzie beztlenowym. Powinien osiągnąć zwalidowany stan końcowy po redukcji w czasie określonym dla produktu. Jeśli którakolwiek kontrola zachowuje się nieprawidłowo, wymień partię, zanim zaufasz odczytom ze słoja.

Protokół odczytu wynika z mechanizmu działania. Umieść pasek w przestrzeni gazowej, w miejscu widocznym bez otwierania słoja, zgodnie z instrukcją produktu dotyczącą kontaktu ze ścianką i zwilżania. Zapisz barwę początkową, czas szczelnego zamknięcia słoja i barwę w punkcie kontrolnym określonym dla produktu. Jeśli naczynie na to pozwala, odnotowuj, że wskaźnik pozostawał w stanie zredukowanym w wyznaczonych punktach kontrolnych podczas inkubacji. Zapisz końcową barwę bezpośrednio przed otwarciem. To barwa sprzed otwarcia stanowi wynik końcowy danego przebiegu. Po otwarciu spodziewaj się ponownego niebieszczenia i nie pozwól, by zmieniło ono ocenę wcześniejszych warunków.

Jeśli pasek pozostaje niebieski po upływie określonego czasu, traktuj warunki beztlenowe jako niepotwierdzone. Sprawdzaj kolejne elementy w następującej kolejności: szczelność, saszetkę, katalizator, jeśli występuje, uwodnienie wskaźnika i termin ważności, a następnie działanie wskaźnika w porównaniu z kontrolą w powietrzu. Dopiero po potwierdzeniu warunków atmosfery można interpretować wzrost lub jego brak, stosując układ hodowli beztlenowej i kontrole drobnoustrojów odpowiednie do danego zastosowania.

Pasek zasługuje na ostatnie słowo w zakresie, do którego został przeznaczony. Niebieski czy bezbarwny, odpowiada na jedno pytanie dotyczące jednego miejsca w jednym momencie. Zadawaj mu to pytanie zgodnie z harmonogramem, z kontrolami obok, a odpowie wiarygodnie. Pytaj go o sterylność, o każdą probówkę albo o całą inkubację na podstawie jednego spojrzenia, a żadna chemia wskaźnika nie uratuje takiej interpretacji.