Dlaczego błękit metylenowy jest używany jako barwnik kontrastowy w barwieniu kwasoopornym

Technik ogląda rozmaz plwociny po zakończeniu całej sekwencji barwienia. Czerwone pałeczki wyróżniają się na niebieskim tle, a w wyniku badania pojawia się informacja, że zaobserwowano prątki kwasooporne. Następnego dnia inny preparat pokazuje jednolite niebieskie pole bez czerwonych pałeczek i zostaje opisany jako wynik ujemny w kierunku gruźlicy. Jeden z tych opisów wykracza poza to, co można stwierdzić na podstawie preparatu — i nie jest to pierwszy z nich.

Nieporozumienie dotyczy samej zasady metody. Technik potraktował niebieski barwnik jako element chemii wykrywania, tak jakby błękit metylenowy pomagał znaleźć prątki. Tak nie jest. W chwili, gdy błękit metylenowy trafia na szkiełko, właściwa próba jest już zakończona. Barwnik jedynie barwi tło, aby wynik był czytelny. Ten artykuł wyjaśnia rolę błękitu metylenowego w barwieniu kwasoopornym, dlaczego stosuje się właśnie kolor niebieski, a nie inny, oraz jakie wnioski można wyciągnąć z czerwieni na niebieskim tle.

Krótka odpowiedź

Barwienie kwasooporne to metoda różnicująca oparta na trzech zasadach. Fuksyna karbolowa, barwnik podstawowy, jest wprowadzana do wszystkich komórek, w tym do prątków o woskowatej osłonie. Alkohol zakwaszony, pełniący funkcję odbarwiacza, usuwa czerwony barwnik ze zwykłych komórek, ale nie z komórek kwasoopornych. Następnie błękit metylenowy, barwnik kontrastowy, barwi wszystkie elementy, z których odbarwiacz usunął barwnik podstawowy. W rezultacie komórki niekwasooporne, komórki gospodarza i szczątki są niebieskie, a prątki kwasooporne pozostają czerwone. Barwnik kontrastowy zapewnia kontrast. Nie uczestniczy w procesach chemicznych, które nadają komórce kwasooporność.

Rola poszczególnych etapów

Poniższy schemat pokazuje podział zadań. Czytaj go od lewej do prawej jako przebieg procedury, a dolny pasek potraktuj jako przypomnienie, że każda grupa metod barwienia odpowiada na inne pytanie.

Najpierw następuje wnikanie barwnika. Prątki opierają się zwykłym barwnikom wodnym, ponieważ ich osłona jest wyjątkowo hydrofobowa, dlatego procedura wymusza wnikanie. W metodzie Ziehla-Neelsena ogrzewanie do pojawienia się pary umożliwia fuksynie karbolowej zawierającej fenol przeniknięcie przez woskowatą ścianę. W metodzie Kinyouna na zimno ogrzewanie zastępuje znacznie bardziej stężony preparat barwnika podstawowego, a niektóre zmodyfikowane wersje bez ogrzewania zawierają dodatkowo środki powierzchniowo czynne. Protokoły barwienia kwasoopornego American Society for Microbiology zestawiają obie receptury, a różnica stężeń jest wyraźna: około 0.3 g fuksyny zasadowej na 100 mL w metodzie z ogrzewaniem wobec około 4 g w metodzie na zimno.

Drugim etapem jest różnicowanie. Alkohol zakwaszony, zwykle 3 mL stężonego kwasu solnego w 97 mL etanolu o stężeniu 95 procent, wypłukuje czerwony barwnik z każdej komórki, której ściana nie wykazuje szczególnej odporności. Komórki z nienaruszoną lipidową osłoną typową dla prątków zatrzymują barwnik. To etap decydujący o działaniu całej metody i najbardziej wrażliwy na sposób wykonania, co omówiono poniżej.

Na końcu powstaje kontrast. Na szkiełku znajdują się teraz czerwone komórki kwasooporne na niemal bezbarwnym tle odbarwionych komórek. Błękit metylenowy o stężeniu 0.3 procent w/v przywraca widoczność tego tła, nadając mu kolor maksymalnie odmienny od czerwieni. Barwienie kontrastowe trwa krótko, zwykle 20 do 30 sekund w metodzie z ogrzewaniem i do kilku minut w niektórych wariantach metody na zimno. Czas zależy od protokołu, a nie od właściwości samego barwnika.

Dlaczego ten barwnik i dlaczego niebieski

Błękit metylenowy jest kationowym barwnikiem zasadowym, co oznacza, że jego barwny jon ma ładunek dodatni i wiąże się z ujemnie naładowanymi powierzchniami odbarwionych bakterii, komórek gospodarza i szczątków. Podręcznik mikrobiologii OpenStax opisuje tę zależność od ładunku jako ogólną zasadę działania barwników zasadowych. Błękit metylenowy nie jest jednak pod tym względem chemicznie wyjątkowy. Fiolet krystaliczny i safranina również są barwnikami zasadowymi. Wybór ma uzasadnienie optyczne, nie chemiczne.

Czerwone pałeczki wymagają tła o kontrastującej barwie, a niebieski zapewnia przeciwstawienie czerwieni szczególnie przydatne w mikroskopii jasnego pola. Safranina byłaby słabym barwnikiem kontrastowym, ponieważ jej końcowe różowoczerwone zabarwienie jest zbyt zbliżone do zatrzymanej fuksyny karbolowej, przez co zacierałaby rozróżnienie uzyskane w tej procedurze. Fiolet krystaliczny dawałby ciemnofioletowe tło, które konkurowałoby z cienkimi czerwonymi prątkami o uwagę obserwatora. Najmocniejszym dowodem na to, że chodzi o kontrast, a nie o chemię, jest możliwość zastąpienia barwnika: w niektórych protokołach weterynaryjnych i zmodyfikowanych stosuje się zielone barwniki kontrastowe, takie jak zieleń malachitowa i zieleń brylantowa, a metoda nadal działa, ponieważ każda wyraźnie odmienna barwa spełnia to samo zadanie.

Wynikają z tego dwie praktyczne konsekwencje. Po pierwsze, standardowa receptura nie przewiduje regulacji pH; nie należy mylić tego zwykłego wodnego roztworu o stężeniu 0.3 procent z preparatami zasadowymi, takimi jak błękit metylenowy Loefflera, które należą do innej koncepcji barwienia. Po drugie, nadmierne barwienie szkodzi. Literatura histologiczna wyraźnie ostrzega, że zbyt intensywne niebieskie tło może maskować nieliczne prątki, więc pozostawianie barwnika na szkiełku dłużej, niż dopuszcza protokół, pogarsza czytelność bez żadnej korzyści.

Chemia ściany komórkowej, dzięki której metoda działa

Przyczyna różnicującego działania alkoholu zakwaszonego tkwi w osłonie prątków. Jej strukturalnym rdzeniem jest kompleks mykolilo-arabinogalaktano-peptydoglikanowy: peptydoglikan połączony z arabinogalaktanem, którego zewnętrzne końce są związane z kwasami mykolowymi o bardzo długich łańcuchach. Tworzą one bogatą w lipidy zewnętrzną mykomembranę o wyjątkowo małej przepuszczalności. Przegląd dotyczący zewnętrznej błony prątków szczegółowo opisuje tę budowę. Bariera działa w obu kierunkach. Utrudnia wnikanie barwnika, dlatego potrzebne jest ogrzewanie lub bardziej stężony barwnik podstawowy, a także utrudnia jego wypłukiwanie, dlatego alkohol zakwaszony nie usuwa fuksyny karbolowej, gdy ta znajdzie się już wewnątrz. Zwykłe bakterie nie mają takiej osłony i tracą barwnik. Kwasooporność najlepiej zatem rozumieć jako zjawisko związane z barierą lipidową, a nie jako chemiczne wiązanie fuksyny z kwasem mykolowym.

Ta chemia wyjaśnia również częstą zagadkę: prątki barwią się metodą Grama słabo i nieprzewidywalnie, czasem przybierając postać bladych, paciorkowatych form lub niewybarwionych zarysów komórek. Ich hydrofobowa ściana ogranicza wnikanie fioletu krystalicznego. Barwienie kwasooporne nie jest zmodyfikowanym barwieniem metodą Grama. Opiera się na innej zasadzie różnicowania i innej właściwości ściany komórkowej, co w odniesieniu do pozostałych dwóch metod pokazuje porównanie barwienia prostego z barwieniem metodą Grama.

Trzy metody, trzy pytania

Szerszą grupę metod barwienia bakterii jednym barwnikiem przedstawia atlas barwień mikroskopowych.

Czego nie dowodzi czerwień na niebieskim tle

Czerwone pałeczki oznaczają, że drobnoustroje zatrzymały fuksynę karbolową mimo działania alkoholu zakwaszonego. Takie stwierdzenie jest zgodne z obecnością Mycobacterium tuberculosis, ale wytyczne CDC dotyczące diagnostyki gruźlicy wyraźnie wskazują, że inne prątki również są kwasooporne. Identyfikacja gatunku wymaga więc hodowli i badań kwasów nukleinowych, a nie oceny koloru.

Błędy wykonania koncentrują się wokół dwóch etapów płukania. Niedostateczne odbarwienie pozostawia czerwone zabarwienie materiału tła i sprzyja wynikom fałszywie dodatnim. Nadmierne odbarwienie usuwa słabo zatrzymany barwnik podstawowy i przyczynia się do wyników fałszywie ujemnych. Zbyt intensywne barwienie kontrastowe maskuje nieliczne prątki w niebieskim tle. Grube rozmazy, wytrącone odczynniki i zanieczyszczona woda do płukania wprowadzają dodatkowe artefakty.

Czułość jest ograniczona liczbą drobnoustrojów, niezależnie od poprawności wykonania. Konwencjonalna mikroskopia rozmazu wymaga około 5,000 do 10,000 prątków na mililitr plwociny, a starsze przeglądy dowodów CDC określały czułość rozmazu na około 45 do 80 procent wśród przypadków gruźlicy płuc potwierdzonych hodowlą. Ujemny wynik rozmazu nigdy więc nie wyklucza gruźlicy. Aktualne wytyczne CDC wymagają hodowli równolegle z każdym rozmazem i zalecają badanie z amplifikacją kwasów nukleinowych przynajmniej jednej próbki z dróg oddechowych, gdy rozważa się gruźlicę płuc, a wynik wpłynąłby na postępowanie.

Praca praktyczna wymaga zatwierdzonych protokołów

Opisy dydaktyczne, w tym ten artykuł, nie uprawniają do wykonywania badań klinicznych. W pracy laboratoryjnej należy stosować zwalidowaną standardową procedurę operacyjną laboratorium, zgodną z aktualnymi dokumentami CDC, APHL lub CLSI; dokument referencyjny CDC dotyczący barwienia kwasoopornego, przechowywany w archiwum Stacks, pokazuje, jak takie procedury określają odczynniki i sposób odczytu. Praca z próbkami do badań w kierunku gruźlicy wymaga zabezpieczeń ograniczających rozprzestrzenianie się materiału biologicznego: rozmazy przygotowuje się w komorze bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ podczas przygotowania powstają aerozole i rozpryski. Wytyczne CDC dotyczące bezpieczeństwa laboratoryjnego stwierdzają, że nawet rozmazy utrwalone termicznie mogą zawierać żywe prątki gruźlicy i nadal muszą być traktowane jako materiał zakaźny. Wpis w bibliotece obrazów zdrowia publicznego CDC przedstawiający rozmaz barwiony fuksyną karbolową i błękitem metylenowym, badany w kierunku M. leprae, przypomina o zastosowaniach metody poza gruźlicą: ten sam kontrast czerwieni na niebieskim tle służy wszędzie tam, gdzie poszukuje się drobnoustrojów kwasoopornych, a starannie ustalony wynik ujemny sam w sobie jest wart odnotowania.

Odczytywanie gotowego preparatu

Barwnik kontrastowy wykazuje swoją przydatność podczas wstępnego przeglądania preparatu. Mikroskopista, przeglądając preparat przy małym powiększeniu, najpierw wykorzystuje niebieskie tło do oceny jakości rozmazu: równomiernego rozmieszczenia komórek, obecności nienaruszonych komórek gospodarza umożliwiających ustawienie ostrości oraz braku obfitego osadu. Następnie uwagę przyciągają czerwone struktury mogące być prątkami, właśnie dlatego, że nic innego na szkiełku nie jest czerwone. Potwierdzenie następuje przy użyciu immersji olejowej, gdy rzeczywiste prątki mają oczekiwaną postać cienkich, czasem lekko zakrzywionych lub paciorkowatych pałeczek, a nie jednolitych drobin barwnika.

Zabarwienie tła wyznacza również sposób formułowania wyniku. Preparat z czerwonymi prątkami opisuje się jako „zaobserwowano prątki kwasooporne”, często z oceną półilościową według skali stosowanej w laboratorium. Preparat bez czerwonych drobnoustrojów opisuje się jako „nie zaobserwowano prątków kwasoopornych”, nigdy jako „wynik ujemny w kierunku gruźlicy”. To rozróżnienie jest ważne, ponieważ niebieskie pole potwierdza, że barwienie zadziałało, komórki przyjęły barwnik kontrastowy, a warunki optyczne były odpowiednie, ale nie mówi nic o drobnoustrojach obecnych poniżej granicy wykrywalności. Niebieskie pole bez widocznych prątków jest prawidłowym wynikiem dotyczącym preparatu, a nie rozstrzygnięciem dotyczącym pacjenta.

Wystarczy pamiętać o podziale zadań, aby poprawnie formułować wyniki. Fuksyna karbolowa uwidacznia potencjalne prątki. Alkohol zakwaszony przeprowadza próbę. Błękit metylenowy jedynie sprawia, że odpowiedź staje się czytelna: czerwone elementy zatrzymały barwnik mimo działania kwasu, niebieskie go utraciły. Wszystko inne — gatunek, liczebność i znaczenie kliniczne — wynika z badań wykraczających poza ocenę preparatu.