Błękit metylenowy i ekspozycja na światło: długość fali, natężenie napromienienia i geometria naświetlania

Dwie publikacje opisują naświetlanie błękitu metylenowego dawką 10 J na cm kwadratowy. W jednym badaniu giną bakterie. W drugim nie dzieje się nic mierzalnego. Czytelnik porównujący wyłącznie dawkę uznaje, że wyniki w tej dziedzinie są niespójne. Są jednak spójne. Dawka nigdy nie opisywała całej ekspozycji.

Ekspozycja na światło to niewielki układ współdziałających parametrów: długość fali, natężenie napromienienia, czas trwania, wynikająca z nich fluencja, dostępność tlenu, stężenie i stan agregacji barwnika, odstęp między podaniem barwnika a naświetlaniem oraz droga optyczna, którą światło rzeczywiście pokonuje w próbce. Zmiana jednego z nich zmienia fotochemię. Ten artykuł omawia kolejno każdy parametr, a następnie odróżnia fotobiomodulację w bliskiej podczerwieni od bezpośredniej fotoaktywacji barwnika, ponieważ te dwa mechanizmy są najczęściej ze sobą mylone.

Długość fali decyduje, czy barwnik uczestniczy w reakcji

Błękit metylenowy w wodzie silnie absorbuje czerwone światło w postaci monomeru, z maksimum w pobliżu 664 do 665 nm i ramieniem pasma przy krótszej długości fali, około 610 nm, które narasta, gdy barwnik agreguje w dimery i większe stosy cząsteczek. Molowy współczynnik ekstynkcji w pobliżu maksimum jest rzędu 65,000 do 85,000 M-1 cm-1, więc już roztwory o stężeniach mikromolowych są intensywnie niebieskie. Wczesny przegląd fotochemii błękitu metylenowego z DNA i substratami biologicznymi dokumentuje tę charakterystykę absorpcji i następującą po niej chemię stanów wzbudzonych: absorpcja prowadzi do obsadzenia krótko żyjącego stanu singletowego, a następnie przejścia do dłużej żyjącego stanu trypletowego z raportowaną wydajnością około 0.5; w napowietrzonym roztworze stan ten jest wygaszany przez tlen w ciągu około 2 mikrosekund.

Na etapie wygaszania rozchodzą się dwie ścieżki fotochemiczne. W chemii typu II barwnik w stanie trypletowym przekazuje energię tlenowi w stanie podstawowym i wytwarza tlen singletowy, z często przytaczaną wydajnością około 0.52. W chemii typu I stan trypletowy przekazuje zamiast tego elektron lub atom wodoru substratowi, wytwarzając rodniki, w tym formy ponadtlenkowe i hydroksylowe. Obie ścieżki mogą zachodzić jednocześnie, a konwencjonalny efekt fotodynamiczny pozostaje silnie zależny od tlenu nawet przy udziale typu I.

Dla wyboru długości fali przy błękicie metylenowym wynika z tego prosta zasada. Czerwone światło od około 630 do 680 nm pokrywa się z pasmem absorpcji barwnika, przy czym 660 do 665 nm przypada blisko maksimum monomeru, więc może napędzać reakcje fotouczulacza wszędzie tam, gdzie występuje istotna ilość barwnika. Bliska podczerwień przy 810 nm leży daleko poza pasmem absorpcji stanu podstawowego, więc słabo nadaje się do bezpośredniego wzbudzania barwnika. Stężenie komplikuje ten obraz w jeden istotny sposób: wraz ze wzrostem stężenia większa część barwnika występuje w postaci dimerów i agregatów, które absorbują bliżej 610 nm i mniej skutecznie uczulają na światło w przeliczeniu na cząsteczkę, dlatego podwojenie ilości barwnika nie podwaja efektu. Powiązany przegląd błękitu metylenowego i terapii czerwonym światłem traktuje tę zasadę absorpcji jako warunek wstępny każdej reakcji fotouczulanej.

Natężenie napromienienia, czas trwania i fluencja to trzy parametry, nie jeden

Fluencja, wyrażana w J na cm kwadratowy, to natężenie napromienienia pomnożone przez czas. Podawanie samej fluencji ukrywa tempo dostarczania energii, a tempo ma znaczenie.

Wysokie natężenie napromienienia przez krótki czas i niskie natężenie przez długi czas mogą dać tę samą fluencję, lecz inną chemię. Wysokie natężenie napromienienia zużywa rozpuszczony tlen szybciej, niż dyfuzja go uzupełnia, co w trakcie ekspozycji ogranicza zależną od tlenu ścieżkę typu II. Powoduje też nagrzewanie, a tkanka reaguje na nie zmianami przepływu krwi, które wpływają zarówno na utlenowanie, jak i rozmieszczenie barwnika. Niskie natężenie napromienienia podczas długiej ekspozycji pozwala utrzymać dopływ tlenu, ale daje procesom naprawy i ponownego utlenowania czas na działanie już podczas samego naświetlania. Podręczniki fotochemii nazywają założenie, że liczy się tylko całkowita dawka, zasadą wzajemności. Zasada ta przestaje obowiązywać, gdy w grę wchodzą tlen, nagrzewanie lub procesy biologiczne, co w tkance oznacza niemal zawsze.

Przeciwdrobnoustrojowe ekspozycje fotodynamiczne z błękitem metylenowym u ludzi często wykorzystują 6 do 18 J na cm kwadratowy, co pokrywa się z wartościami stosowanymi w fotobiomodulacji. Sama fluencja nie pozwala więc rozpoznać mechanizmu. Ekspozycja 10 J na cm kwadratowy przy 660 nm w tkance zawierającej barwnik to fotochemia napędzana przez fotouczulacz. Ta sama fluencja przy 810 nm w tkance ze śladową ilością barwnika jest czymś zupełnie innym. Liczba się zgadza. Pojęcie jest inne.

Droga optyczna i geometria próbki decydują, na co trafia światło

Prawo Lamberta-Beera oznacza, że przednia część próbki otrzymuje znacznie więcej światła niż tylna. W kuwecie z barwnikiem o stężeniu kilkudziesięciu mikromoli pierwszy milimetr może pochłonąć większość padającego czerwonego światła, pozostawiając głębsze warstwy praktycznie nienaświetlone. Jeśli ten sam roztwór umieścimy w małej objętości w płytkim dołku, ekspozycja staje się niemal równomierna. Ten sam barwnik, ta sama lampa, ta sama fluencja na powierzchni, inny wynik.

W tkance do absorpcji dochodzi rozpraszanie. Czerwone światło w pobliżu 660 nm przenika na głębokość rzędu milimetrów, a dokładna głębokość zależy od zawartości krwi, pigmentacji i rodzaju tkanki. Dołki wprowadzają własne artefakty: soczewkowanie przez menisk, odbicia od ścianek, zacienienie dołków przy krawędzi i ogrzewanie małych objętości pod źródłem światła. Dwa laboratoria podające identyczne ustawienia lampy, ale różne typy płytek, objętości lub odległości od źródła, przeprowadziły różne eksperymenty.

Odległość zasługuje na szczególną uwagę, ponieważ jest najczęstszą nieujawnioną zmienną. Natężenie napromienienia szybko maleje wraz z odległością od nieskolimowanego źródła, więc przesunięcie lampy z 2 cm na 5 cm nad płytką może zmniejszyć je kilkukrotnie, choć opis metod nadal brzmi tak samo. Bez pomiaru natężenia napromienienia na powierzchni próbki opublikowane fluencje obliczone na podstawie mocy podanej przez producenta są szacunkami, a nie pomiarami.

Przewodnik po parametrach z objaśnieniami: co zapewnia odtwarzalność ekspozycji

Autorski materiał na tej stronie to lista kontrolna. Ekspozycji na światło w badaniu, które pomija te informacje, nie można porównać z inną, niezależnie od tego, jak podobnie wygląda podana dawka.

1. Długość fali i szerokość pasma. Maksimum i pełna szerokość, nie nazwa koloru. Czerwone diody LED obejmują zakres 630 do 680 nm, w którym absorpcja barwnika bardzo się różni.
2. Zmierzone natężenie napromienienia na powierzchni próbki, w mW na cm kwadratowy. Moc w watach podana przez producenta nie jest natężeniem napromienienia.
3. Czas trwania i pulsowanie. Naświetlanie ciągłe lub impulsowe, z uwzględnieniem częstotliwości impulsów i współczynnika wypełnienia, jeśli mają zastosowanie.
4. Fluencja obliczona z powyższej pary zmierzonych parametrów, w J na cm kwadratowy.
5. Stężenie barwnika, formulacja i stan agregacji. Monomer w pobliżu 664 nm uczula na światło inaczej niż agregaty w pobliżu 610 nm.
6. Odstęp między podaniem leku a naświetlaniem. Minuty lub godziny między podaniem barwnika a naświetlaniem, które określają, gdzie znajduje się barwnik, gdy dociera światło.
7. Utlenowanie. Napowietrzony roztwór w porównaniu z niedotlenioną tkanką bezpośrednio zmienia równowagę między typem I a typem II.
8. Geometria. Głębokość próbki, objętość, rodzaj naczynia, odległość i kąt ustawienia źródła oraz głębokość docelowej tkanki.

Przydatny nawyk podczas czytania publikacji: najpierw sprawdź odstęp między podaniem leku a naświetlaniem. Ujawnia on zamysł badania. W badaniach fotodynamicznych celowo naświetla się tkankę zawierającą barwnik. W badaniach łączących interwencje można je celowo rozdzielać, jak poniżej.

Fotobiomodulacja w bliskiej podczerwieni nie jest fotoaktywacją barwnika

Fotobiomodulacja, zwykle określana skrótem PBM, wykorzystuje czerwone światło lub bliską podczerwień do modulowania endogennej sygnalizacji bez dodawania fotouczulacza. Terapia fotodynamiczna, zwykle określana skrótem PDT, wykorzystuje wspólnie trzy elementy: światło absorbowane przez fotouczulacz, sam fotouczulacz i tlen, aby wywołać gwałtowne powstanie reaktywnych form uszkadzających cel. Przegląd mitochondriów jako celu neuroprotekcji zestawia błękit metylenowy z PBM, ponieważ oddziałują one na oddychanie komórkowe z różnych stron: barwnik działa jako katalityczny mediator cyklu redoks wspierający przepływ elektronów, natomiast według hipotezy PBM sprzyja odłączaniu hamującego tlenku azotu od oksydazy cytochromu c w kompleksie IV. Ten mechanizm enzymatyczny należy nadal określać jako hipotezę.

Dwa najczęściej cytowane badania na myszach łączące te interwencje wykorzystują światło 810 nm, i właśnie dlatego nie dowodzą fotoaktywacji barwnika. W badaniu interwencji przed deprywacją snu przed deprywacją myszy codziennie otrzymywały błękit metylenowy w dawce 0.5 mg na kg, co drugi dzień naświetlanie laserem impulsowym 810 nm albo obie interwencje. Połączona interwencja wstępna chroniła zachowania związane z pamięcią i białka synaptyczne hipokampa, podczas gdy pojedyncze interwencje w dużej mierze nie przynosiły efektu. W badaniu przewlekłego stresu z równoległym leczeniem myszy otrzymywały PBM przy 810 nm i fluencji 8 J na cm kwadratowy wraz z codziennym podawaniem barwnika w dawce 0.5 mg na kg; najpierw stosowano laser, a barwnik wstrzykiwano dwie godziny później, specjalnie po to, aby uniknąć naświetlania tkanki zawierającej barwnik. Wszystkie trzy warianty odwracały deficyty uczenia się, a korzyść addytywna dotyczyła głównie stężenia kortyzolu w surowicy i reaktywnych form tlenu w mózgu. Wyniki te sprawdzają dwie interwencje mitochondrialne stosowane razem; zbiór badań fotodynamicznych uwidacznia to rozróżnienie, odnotowując długość fali dla każdego wskazania.

Dane dotyczące skóry znajdują się po drugiej stronie tego podziału. Dane z badań u ludzi nad błękitem metylenowym i światłem w zastosowaniach skórnych skupiają się w zakresie 630 do 680 nm, z barwnikiem stosowanym miejscowo lub podawanym do zmian oraz z zamiarem niszczenia lub przebudowy, co z definicji jest PDT. Przytaczanie ustąpienia zmian jako dowodu, że barwnik wzmacnia PBM, albo przytaczanie efektu przywrócenia funkcji u myszy przy 810 nm jako dowodu, że panel 660 nm wraz z barwnikiem stanowi protokół dotyczący funkcji poznawczych, miesza te mechanizmy. Materiał referencyjny o dawkowaniu i farmakologii oraz przewodnik po bezpieczeństwie i interakcjach rozwijają wątki stężenia i przeciwwskazań.

Zanim porównasz liczby, nazwij mechanizm. Długość fali określa, czy barwnik absorbuje światło. Natężenie napromienienia i czas trwania określają, jak przebiega chemia po tej absorpcji. Geometria określa, która część próbki w ogóle tego doświadcza. Dwie ekspozycje zgodne pod względem jednego parametru, a różniące się pozostałymi, to różne eksperymenty; traktowanie ich jako zamiennych jest błędem, któremu ma zapobiegać ten przewodnik. Nie wynika z tego żaden protokół do stosowania w domu; światło o długości fali zgodnej z absorpcją barwnika wraz z barwnikiem podanym ogólnoustrojowo przekształca ekspozycję, która w innych warunkach miałaby charakter modulacyjny, w fotochemię napędzaną przez fotouczulacz, należącą do praktyki klinicznej.