Pomiar wpływu błękitu metylenowego na mitochondria: tlen, ATP i potencjał błonowy

Załóżmy, że laboratorium dodaje błękit metylenowy do mitochondriów z upośledzonym oddychaniem i obserwuje wzrost zużycia tlenu. Naturalnym wnioskiem wydaje się stwierdzenie, że barwnik przywrócił funkcję mitochondriów. To stwierdzenie może być błędne. Strumień tlenu, synteza ATP i potencjał błonowy to trzy odrębne pojęcia. Dotyczą tego samego organellum tak, jak tworzenie kopii zapasowych, synchronizacja i udostępnianie dotyczą tego samego folderu w chmurze: są powiązane, ale rządzą się różnymi zasadami. Pomylenie jednego z drugim prowadzi do błędnej interpretacji, nawet gdy każdy pomiar jest technicznie poprawny.

Błękit metylenowy sprzyja takiemu pomieszaniu, ponieważ uczestniczy w działaniu układu, który jest mierzony. To związek uczestniczący w cyklach redoks, który przyjmuje elektrony na wcześniejszych etapach szlaku i oddaje je na późniejszych, lipofilowy kation gromadzący się w mitochondriach z wytworzonym potencjałem oraz intensywnie niebieski związek absorbujący i emitujący światło w tych samych pasmach co powszechnie stosowane sondy. Pojedynczy odczyt nie wystarczy, by rozdzielić te efekty. Wiarygodne podejście, stosowane w budapeszteńskich badaniach mitochondrialnych, polega na pomiarze strumienia tlenu, szybkości syntezy ATP, potencjału błonowego i uwalniania nadtlenku wodoru, z kontrolami swoistymi dla barwnika na każdym etapie.

Respirometria mierzy strumień tlenu, a nie produkcję energii

Respirometria wysokiej rozdzielczości, prowadzona za pomocą Oroboros Oxygraph lub analizatora strumieni zewnątrzkomórkowych Seahorse, dostarcza jednej informacji: jak szybko redukowany jest tlen. Nie pokazuje, ile protonów przepompowano na elektron, jaka część gradientu została zachowana ani czy syntaza ATP go wykorzystała.

Terminologia ma znaczenie. W izolowanych mitochondriach substrat bez ADP pozwala określić oddychanie związane z przeciekiem protonów, substrat z wysycającym stężeniem ADP — zdolność do fosforylacji oksydacyjnej, a miareczkowanie rozprzęgaczem — maksymalną zdolność transportu elektronów. W nienaruszonych komórkach odpowiednikami w pomiarach Seahorse są oddychanie podstawowe, wrażliwe na oligomycynę oddychanie związane z produkcją ATP, przeciek protonów, maksymalne oddychanie wyznaczone przez FCCP oraz niemitochondrialne zużycie tlenu niewrażliwe na rotenon i antymycynę. Nazywanie wyników Seahorse stanem 3 i stanem 4 sugeruje precyzję, na którą ten układ eksperymentalny nie pozwala, co wyraźnie pokazują założenia testu Agilent Mito Stress Test.

Błękit metylenowy zrywa intuicyjny związek między większym zużyciem tlenu a większą produkcją energii. W izolowanych mitochondriach mózgu świnki morskiej barwnik w stężeniu od 100 nM do 1 uM zwiększał spoczynkowe zużycie tlenu przy zastosowaniu glutaminianu z jabłczanem, bursztynianu i alfa-glicerofosforanu jako substratów; dla alfa-glicerofosforanu wzrost wynosił około 64 procent. Jednocześnie oddychanie stymulowane ADP w zdrowych mitochondriach pozostawało zasadniczo niezmienione, zgodnie z badaniem izolowanych mitochondriów mózgu. Ponieważ oddychanie związane z przeciekiem wzrosło, a strumień stymulowany ADP pozostał bez zmian, obliczony współczynnik kontroli oddechowej maleje. Ten spadek nie oznacza, że barwnik uszkodził mitochondria. Oznacza, że do prawidłowego oddychania dołączył zużywający tlen cykl redoks. Test zużycia tlenu z błękitem metylenowym, który pokazuje tylko wzrost, mierzy rzeczywisty proces chemiczny, ale nie mówi nic o zachowaniu energii.

Eksperymenty dotyczące przywracania funkcji pokazują tę samą rozbieżność w większej skali. Po zablokowaniu kompleksu I strumień tlenu wzrósł około trzykrotnie, podczas gdy synteza ATP wzrosła jedynie około 1.5-krotnie. Więcej tlenu docierało do elektrody. Mniejsza jego część przekładała się na produkcję ATP. Każde twierdzenie o poprawie fosforylacji oksydacyjnej wymaga uwzględnienia ATP w bilansie, najlepiej w postaci stosunku ATP do tlenu, z podaniem przyjętej konwencji dla mianownika.

Testy ATP mierzą szybkość syntezy, której nie zastąpi pomiar zawartości

Test ATP odpowiada na inne pytanie: ile ATP powstaje w jednostce czasu. Odczyt kinetyczny — zarówno luminescencja lucyferazy świetlika śledzona przez kilka minut, jak i sprzężony test z heksokinazą oraz dehydrogenazą glukozo-6-fosforanową z odczytem przy 340 nm — daje szybkość. Pojedynczy pomiar końcowy całkowitego ATP określa zawartość, która odzwierciedla syntezę pomniejszoną o zużycie i sama w sobie niewiele mówi o fosforylacji oksydacyjnej.

Zespół z Budapesztu zastosował sprzężoną metodę enzymatyczną przy zahamowanej kinazie adenylanowej i stwierdził, że błękit metylenowy w stężeniu od 1 do 2 uM nieznacznie, lecz istotnie zwiększał produkcję ATP w mitochondriach poddanych działaniu rotenonu i antymycyny. To rzeczywiste, ale częściowe przywrócenie funkcji. Badanie toksyczności TEGDMA przyniosło podobny wynik w innym modelu: monomer stomatologiczny TEGDMA w stężeniu 5 mM obniżył oddychanie związane z kompleksem I z około 286 do 28 jednostek strumienia, a barwnik w stężeniu 2 uM przywrócił je do około 86.

W przypadku barwnego związku redoks dwie kontrole są niezbędne. Po pierwsze, należy zastosować oligomycynę, aby ustalić, jaka część mierzonej syntezy ATP zależy od syntazy ATP. Po drugie, należy wykonać bezkomórkowy test odzysku po dodaniu znanej ilości ATP, pełnego zestawu odczynników i dokładnie tych stężeń barwnika, które zastosowano w eksperymencie — co najmniej 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM. Barwnik może absorbować emitowane światło, hamować enzym reporterowy lub zmieniać reakcje redoks odczynników, a ogólne wytyczne dotyczące testów lucyferazowych zalecają dodatkowe biochemiczne testy kontrolne właśnie dla tej klasy zakłóceń. Nie należy zakładać, że 1 uM nie powoduje artefaktów tylko dlatego, że wygaszanie jest zwykle silniejsze przy wyższych stężeniach.

Sondy potencjału błonowego mierzą rozmieszczenie barwnika, a nie strumień

Safranina O, TMRM i TMRE, rodamina 123 oraz JC-1 są kationami przenikającymi przez błony. Gromadzą się w ujemnie naładowanej macierzy zgodnie z równowagą elektrochemiczną, więc fluorescencja całej próbki pośrednio informuje o potencjale poprzez rozmieszczenie sondy. Żadna z nich nie mierzy ATP ani strumienia elektronów.

Każda sonda najlepiej sprawdza się w określonym układzie. Safranina O nadaje się do izolowanych mitochondriów i permeabilizowanych komórek, zwykle przy stężeniu około 2 uM, wzbudzeniu około 495 nm i emisji około 585 nm, w trybie wygaszania, w którym wychwyt zmienia fluorescencję całej próbki. TMRM i TMRE nadają się do nienaruszonych komórek przy niskich, nanomolowych stężeniach używanych do znakowania, w trybie bez wygaszania, w którym depolaryzacja uwalnia barwnik i obniża fluorescencję mitochondrialną; przy wysokim stopniu znakowania kierunek zmian sygnału może się odwrócić wskutek samowygaszania. JC-1 daje wygodny stosunek sygnału zielonego do czerwonego, ale zależy od stopnia znakowania i masy mitochondriów, co czyni go mniej odpowiednim do pomiarów ilościowych niż starannie kontrolowany TMRM. Te kompromisy podsumowano w szeroko wykorzystywanym przeglądzie sond potencjału błony mitochondrialnej.

Błękit metylenowy powoduje zakłócenia optyczne właśnie w stosowanych stężeniach roboczych. Jego pasma absorpcji w zakresie około 600 do 665 nm nakładają się na czerwoną emisję sond, więc efekt filtra wewnętrznego, wygaszanie i absorpcja światła wzbudzającego są realnymi możliwościami. Barwnik jest również drugim lipofilowym kationem, którego własne rozmieszczenie zmienia się wraz z mierzonym potencjałem. Zabezpieczeniem są niezależne pomiary i próby ślepe: sama sonda, sam barwnik, sonda z każdym stężeniem barwnika, pełna depolaryzacja za pomocą FCCP jako punkt odniesienia dla zera oraz, najlepiej, druga sonda o odmiennych właściwościach optycznych. Badanie obejścia kompleksu III wyznaczyło taki standard, powtarzając pomiar przywracania potencjału błonowego z użyciem zarówno safraniny O, jak i TMRM po zahamowaniu antymycyną i myksotiazolem oraz uzyskując taki sam jakościowy efekt. Jeden reporter optyczny daje wskazówkę. Dwa niezależne reportery dostarczają dowodów.

Trzy układy eksperymentalne, trzy różne pytania

Izolowane mitochondria, permeabilizowane komórki i nienaruszone komórki nie są wymiennymi ustawieniami czułości jednego testu. To różne układy o odmiennych zasadach działania.

Izolowane mitochondria zachowują łańcuch transportu elektronów, błonę wewnętrzną i aparat macierzy, ale pozbawione są błony komórkowej, cytozolu i architektury sieci mitochondrialnej. Właśnie o to chodzi: substraty, ADP, inhibitory i stężenia barwnika są dokładnie określone, co pozwala przypisać efekt do konkretnego szlaku. Ceną jest utrata naturalnego zaopatrzenia w substraty, sygnalizacji i zapotrzebowania energetycznego.

Permeabilizowane komórki zachowują mitochondria w dużej części ich architektury komórkowej, a jednocześnie pozwalają egzogennym substratom i ADP przenikać przez otwartą błonę komórkową. Są właściwym narzędziem do przypisania zaburzenia do szlaku wykorzystującego dany substrat w kontekście komórkowym. Nadmierna permeabilizacja uszkadza błonę zewnętrzną mitochondriów, a wypłukiwanie składników cytozolu prowadzi do utraty regulacji.

Nienaruszone komórki zachowują wszystko: barierę błony komórkowej, reduktory cytozolowe, transport endogennych substratów, sieć mitochondrialną i zapotrzebowanie na ATP. Są najbliższe fizjologii, ale najdalej od bezpośredniego wyjaśnienia mechanizmu, ponieważ wychwyt, redukcja i sekwestracja barwnika wpływają na jego rzeczywistą dostępność w mitochondriach.

W badaniu TEGDMA celowo wykorzystano wszystkie trzy poziomy: izolowane mitochondria mózgu do badania przywracania utleniania i potencjału przez barwnik, permeabilizowane komórki macierzyste miazgi zębowej głównie do zlokalizowania zaburzenia w utlenianiu substratów związanym z kompleksem I oraz nienaruszone komórki macierzyste do oceny fizjologicznego efektu netto barwnika w stężeniu 2 uM na obniżone zużycie tlenu. Czytelnikom porównującym pomiary mitochondrialne w różnych układach towarzyszący artykuł wyjaśniający, jak błękit metylenowy przenosi elektrony przez łańcuch oddechowy, dostarcza informacji o szlakach, a przewodnik po interpretacji badań oddychania z błękitem metylenowym omawia logikę doboru stężeń i inhibitorów.

Kontrole wymagane dla barwnika aktywnego redoks

Związek uczestniczący w cyklach redoks wymaga dłuższej listy kontroli niż zwykły inhibitor, ponieważ reakcje chemiczne samego barwnika mogą naśladować procesy biologiczne.

W respirometrii należy przeprowadzić pomiar w komorze zawierającej wyłącznie bufor, aby ocenić dryft, w komorze z buforem i barwnikiem bez materiału biologicznego oraz dla barwnika z każdym reduktorem zewnątrzkomórkowym obecnym w teście. Na końcu należy dodać rotenon i antymycynę, aby określić niemitochondrialne zużycie tlenu w nienaruszonych komórkach. Warto pamiętać, że zredukowany barwnik ponownie się utlenia, przekazując elektrony tlenowi i tworząc nadtlenek wodoru. Dlatego próba ślepa z samym barwnikiem, bez donora elektronów, zaniża bezkomórkowe zużycie tlenu występujące wtedy, gdy dostępne są NADH lub NADPH.

Do pomiaru nadtlenku wodoru należy preferować skalibrowany test Amplex UltraRed z peroksydazą chrzanową zamiast nieselektywnych barwników DCFDA, zweryfikować wynik za pomocą katalazy i sprawdzić zależność od oświetlenia, ponieważ barwnik jest fotouczulaczem. W badaniu mitochondriów mózgu stwierdzono, że już przy stężeniu barwnika 100 nM obciążenie nadtlenkiem wzrosło ponad czterokrotnie, a jego usuwanie zwolniło; nadtlenek powstawał bezpośrednio w wyniku reakcji zredukowanego barwnika, bez pośredniego udziału anionorodnika ponadtlenkowego. Szczegóły doboru sond i kontroli oświetlenia omówiono w towarzyszącym artykule o pomiarze reaktywnych form tlenu w eksperymentach z barwnikami, a szersze zagadnienie tego, kiedy nadtlenek działa jako sygnał, a kiedy stanowi obciążenie, poruszono wraz z komórkową równowagą redoks i twierdzeniami o działaniu antyoksydacyjnym.

Przy formułowaniu twierdzeń dotyczących szlaku należy przetestować oba miejsca działania inhibitorów kompleksu III: antymycynę A w miejscu Qi i myksotiazol w miejscu Qo, a także przeprowadzić końcową próbę z cyjankiem blokującym kompleks IV. Wcześniejsze badanie mózgu myszy wykazało przywracanie przez barwnik oddychania zablokowanego rotenonem, ale nie antymycyną, natomiast późniejsze badanie obejmujące trzy gatunki wykazało częściowe przywrócenie przy obu inhibitorach oraz dowody bezpośredniej redukcji cytochromu c. Obejście należy traktować jako zgodne z nowszymi danymi, a nie jako rozstrzygnięty mechanizm, ponieważ stężenie barwnika, miejsce działania inhibitora, warunki substratowe i rozmieszczenie barwnika zmieniają obserwowaną drogę przepływu elektronów.

Tabela doboru testów

Ta tabela pomaga dobrać pomiar do pytania, a nie odwrotnie.

Minimalny zestaw pozwalający sformułować przekonujący wniosek obejmuje zastosowanie tych samych stężeń barwnika — 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM — do pomiaru strumienia tlenu w warunkach oddychania związanego z przeciekiem protonów oraz w obecności ADP, oligomycyny i rozprzęgacza, szybkości syntezy ATP, potencjału błonowego z użyciem najlepiej dwóch sond oraz skalibrowanego uwalniania nadtlenku z kontrolami z katalazą i bez komórek. Należy podać powiązany zestaw wyników: strumień tlenu, szybkość syntezy ATP, stosunek ATP do tlenu, potencjał i nadtlenek. Każda z tych liczb osobno jest pomiarem, któremu dopiero trzeba nadać znaczenie.