Błękit metylenowy a autofagia: AMPK, mTOR i eksperymenty na komórkach nerwowych

Wyobraź sobie, że prowadzisz eksperyment na komórkach, dodajesz błękit metylenowy i widzisz, jak prążek białka o nazwie LC3-II ciemnieje na błonie po immunoblottingu. Kusi, by ogłosić, że związek „nasila autofagię”, i przejść dalej. Taka interpretacja jest przedwczesna. Ciemniejszy prążek LC3-II może oznaczać, że komórka wytwarza więcej pęcherzyków służących do usuwania zbędnych składników, ale może też oznaczać, że pęcherzyki się gromadzą, ponieważ etap ich usuwania jest zablokowany. Te dwie interpretacje prowadzą do przeciwstawnych wniosków, a literatura dotycząca błękitu metylenowego i komórek nerwowych zawiera przykłady dowodów obu rodzajów. W tym artykule omawiamy, co faktycznie mierzono, metoda po metodzie.

Makroautofagia, czyli badana tu forma autofagii, to proces zbiorczego recyklingu składników komórki. Błoniasty woreczek zwany fagoforem rozrasta się wokół zużytych białek i organelli, zamyka się w autofagosom, łączy z lizosomem, a jego zawartość zostaje rozłożona i uwolniona do ponownego wykorzystania. Neurony są zależne od tego procesu, ponieważ nie dzielą się i nie mogą zmniejszać stężenia uszkodzonych składników przez podział. Gdy recykling się zatrzymuje, odpady się gromadzą. Gdy działa, komórka odzyskuje materiał budulcowy w warunkach stresu.

Co wykazał jeden eksperyment na komórkach hipokampa

W kluczowym badaniu indukcji wykorzystano mysie komórki hipokampa HT22 poddane stresowi przez pozbawienie surowicy na 24 godziny. Takie warunki odbierają komórkom czynniki wzrostu i sygnały troficzne oraz uruchamiają zarówno apoptozę, jak i autofagię. Badacze odnotowali, że błękit metylenowy ograniczał śmierć komórek w sposób zależny od dawki, a temu działaniu ochronnemu towarzyszyły oznaki makroautofagii.

Zmiany markerów miały konkretny charakter. Rozproszone barwienie LC3B przechodziło w okołojądrowe skupiska punktowe już przy około 20 nM błękitu metylenowego, a najsilniejszą odpowiedź LC3-I i LC3-II obserwowano w pobliżu 1 μM. Poziomy zarówno LC3B-I, jak i LC3B-II wzrastały w sposób zależny od dawki i czasu. Co istotne, zespół poszedł o krok dalej niż statyczny pomiar LC3 metodą immunoblottingu. Badacze dodali 10 μM chlorochiny, która blokuje usuwanie zawartości przez lizosomy, i stwierdzili wyższy poziom LC3-II oraz stabilizację p62 w komórkach poddanych działaniu błękitu metylenowego. Taki wzorzec przemawia za obrotem składników zależnym od lizosomów, a nie jedynie ich nagromadzeniem. Wykazali również, że chlorochina częściowo odwracała efekt antyapoptotyczny, co wiąże ochronę ze szlakiem autofagiczno-lizosomalnym w tym modelu.

Wynik dotyczący sygnalizacji jest najczęściej błędnie przytaczany. Sygnalizacja AMPK, oceniana na podstawie fosforylowanej AMPK oraz fosforylowanej ACC, będącej jej dalszym celem, nasilała się po 12 i 24 godzinach w sposób zależny od dawki. Inhibitor AMPK, Compound C, zastosowany w stężeniu 20 μM podczas ostatnich 4 godzin, zmniejszał zarówno fosforylację ACC, jak i aktywację LC3. Natomiast w przypadku fosforylowanego mTOR nie wykryto obniżenia poziomu. Zatem w komórkach hipokampa poddanych stresowi stwierdzono indukcję związaną z AMPK, przebiegającą drogą najwyraźniej niezależną od mTOR. Ten sam wzorzec zaobserwowano u żywych myszy, u których podanie błękitu metylenowego indukowało markery makroautofagii w korze mózgowej i hipokampie.

Indukcja nie oznacza pełnego przepływu autofagicznego

W tym miejscu rozróżnienie pojęć ma największe znaczenie. Indukcja oznacza, że mechanizmy uruchamiające proces wytwarzają więcej autofagosomów. Przepływ oznacza, że zawartość przechodzi całą drogę: sekwestrację, dojrzewanie, fuzję z lizosomem, degradację i recykling. Każdy wzrost LC3-II stanowi jedynie podstawę do wnioskowania o indukcji, dopóki test przepływu nie potwierdzi pozostałych etapów.

Standardowy test przepływu polega na pomiarze LC3-II z krótkotrwałą blokadą lizosomalną, wywołaną na przykład bafilomycyną A1 lub chlorochiną, oraz bez takiej blokady. Jeśli badany czynnik rzeczywiście przyspiesza wytwarzanie, zablokowanie rozkładu powinno jeszcze bardziej podnieść poziom LC3-II. Tandemowy reporter mCherry-GFP-LC3 pozwala spojrzeć na proces z innej strony: struktury świecą na żółto przed fuzją z lizosomem, a wyłącznie na czerwono po wygaszeniu sygnału GFP przez kwaśne środowisko. Większa liczba punktów świecących wyłącznie na czerwono przemawia więc za postępem procesu do etapu kwaśnych autolizosomów. Spadek poziomu białka p62 może potwierdzać obrót zawartości, z zastrzeżeniem, że sama transkrypcja p62 reaguje na stres i należy ją sprawdzić na poziomie mRNA.

Poniższa lista kontrolna zestawia każdą metodę stosowaną w tej literaturze z tym, co mierzy i czego sama nie może udowodnić. Czytelnicy mogą wykorzystać ją do oceny dowolnych przyszłych twierdzeń dotyczących makroautofagii, w tym argumentów dotyczących postu i długowieczności, które odwołują się do tych markerów.

Warto zwrócić uwagę na jedną pułapkę językową, przed którą chroni ta tabela. Fosforylowana ACC jest formą o zahamowanej aktywności enzymatycznej. Wzrost jej poziomu świadczy o efekcie działania AMPK, a nie o aktywacji ACC.

Sformułowanie „zahamowanie makroautofagii zniosło neuroprotekcję” wymaga takiej samej precyzji. W modelu HT22 oznacza ono, że zakłócenie szlaku autofagiczno-lizosomalnego zniosło poprawę przeżywalności zapewnianą przez błękit metylenowy w warunkach pozbawienia surowicy. Wskazuje to, że autofagia była niezbędna lub współuczestniczyła w tym efekcie w tej hodowli. Nie dowodzi, że autofagia jest jedynym mechanizmem ochronnym związku, ani że chlorochina działa wyłącznie za pośrednictwem autofagii. Aby wzmocnić wniosek o związku przyczynowym, potrzebna byłaby genetyczna ingerencja w ATG5, ATG7 lub ULK1.

Dwie drogi do tego samego mechanizmu

Pomocny jest uproszczony schemat. Stres energetyczny zwiększa aktywność AMPK, AMPK aktywuje kompleks ULK1 i rozpoczyna się autofagia. Czynniki wzrostu i składniki odżywcze zwiększają aktywność mTORC1, mTORC1 hamuje ULK1, a autofagia pozostaje wyłączona. W dalszej części szlaku, za ULK1, kompleks Beclin-1 i VPS34 inicjuje powstawanie fagoforu, LC3-I ulega lipidacji do LC3-II, autofagosom się zamyka, łączy z lizosomem, a jego zawartość zostaje rozłożona wraz z obrotem p62.

Schemat umieszcza na tej mapie poszczególne wyniki dotyczące błękitu metylenowego: wynik z komórek hipokampa przy gałęzi AMPK, a wynik z komórek progenitorowych przy gałęzi mTOR.

Takie ujęcie wyjaśnia pozorną rozbieżność z drugim badaniem Xie. W proliferujących szczurzych nerwowych komórkach progenitorowych osobny eksperyment wykazał, że 5 μM błękitu metylenowego hamowało proliferację i sprzyjało przejściu w stan spoczynku. Liczba komórek dodatnich pod względem Ki67 spadała w dniach 1 i 3, natomiast różnicowanie komórek ukierunkowanych na linię neuronalną pozostawało zachowane. W tym przypadku mechanizm przebiegał przez hamowanie sygnalizacji mTOR: obniżenie poziomu całkowitego i fosforylowanego mTOR wraz z niższą ekspresją p70S6K i 4EBP1 oraz obniżeniem ekspresji cyklin E1, B1, D1 i D2. Dominującym fenotypem był stan spoczynku komórek progenitorowych, który autorzy powiązali z opóźnioną senescencją, a nie z ratowaniem komórek hipokampa poddanych stresowi.

Między tymi dwiema publikacjami nie ma sprzeczności. AMPK i mTOR są integratorami zależnymi od kontekstu, a nie przełącznikami o stałym działaniu. Komórka przypominająca neuron, poddana stresowi, może angażować AMPK bez mierzalnego hamowania mTOR, podczas gdy komórka progenitorowa pobudzana mitogenami może reagować na ten sam związek ograniczeniem zależnych od mTOR mechanizmów wzrostu. Typ komórki, kontekst stresu, stężenie i moment pomiaru decydują o tym, która gałąź dominuje. Dlatego do tego samego obrazu należą również wpływ błękitu metylenowego na energetykę mitochondriów i procesy redoks: jak opisuje przegląd mechanizmów neuroprotekcji, związek ten działa jako alternatywny przenośnik elektronów, angażuje sygnalizację antyoksydacyjną i antyapoptotyczną, hamuje MAO i NOS oraz wiąże się z odnową mitochondriów poprzez biogenezę i autofagię. Autofagia jest jedną z gałęzi jego wielokierunkowego działania, a nie całością tego działania.

Czego eksperymenty nie wykazują

Pozbawienie surowicy modeluje stres troficzny i metaboliczny w hodowli komórkowej. Nie modeluje postu całego organizmu: glukoza, aminokwasy i sole pozostają w podstawowej pożywce, a zachowania związane z pobieraniem pokarmu nie występują. Stężeń stosowanych w hodowlach, od 20 nM do 5 μM, nie można przeliczyć arytmetycznie na dawki dla ludzi, ponieważ wchłanianie, wiązanie z białkami, stan redoks, metabolizm, gromadzenie w tkankach i czas ekspozycji są odmienne.

Żadnego badania z udziałem ludzi nie zaprojektowano tak, by wykazać przepływ autofagiczny indukowany błękitem metylenowym u pacjentów. Dowody mechanistyczne nadal pochodzą z badań komórkowych, ex vivo i na zwierzętach, a przeglądy wciąż określają dowody dotyczące przełożenia tych wyników na praktykę kliniczną jako wstępne. Badania te nie wykazują zatem, że błękit metylenowy odtwarza efekty postu, wydłuża życie ludzi poprzez autofagię ani zapewnia pełny przepływ autofagiczny w ludzkim mózgu. Twierdzenia o naśladowaniu postu i długowieczności wymagają własnych dowodów klinicznych, a badania błękitu metylenowego u ludzi w innych wskazaniach nie stają się badaniami autofagii tylko przez skojarzenie. Prace dotyczące modeli stresu wynikającego z niedoboru składników odżywczych i modeli długowieczności należy czytać z uwzględnieniem tej granicy.

Przy lekturze kolejnej publikacji zastosuj listę kontrolną w podanej kolejności. Najpierw zapytaj, w której gałęzi zaszła zmiana: AMPK, mTOR czy w żadnej. Następnie sprawdź, czy wynik dotyczący LC3 zestawiono z testem przepływu, czy przedstawiono go samodzielnie. Potem ustal, czy zablokowanie szlaku zniosło korzyść i jaką metodą to zrobiono. Badanie, które odpowiada na wszystkie trzy pytania, daje mocne podstawy do wniosku mechanistycznego. Takie, które odpowiada tylko na pierwsze, wykazało sygnał zezwalający na uruchomienie procesu, a pozostała część drogi pozostaje niezbadana.