Błękit metylenowy i komórki wspierające mózg: astrocyty, mikroglej i stan zapalny

Załóżmy, że przeprowadzasz dwa eksperymenty z tym samym niebieskim barwnikiem i uzyskujesz dwa obiecujące wyniki. W jednej szalce gwiaździste komórki wspierające przeżywają pozbawienie tlenu i glukozy. W drugiej komórki odpornościowe mózgu zachowują spokojną, rozgałęzioną postać mimo obecności toksyny bakteryjnej. Kuszące jest połączenie tych wyników w jedno stwierdzenie: barwnik łagodzi stan zapalny w mózgu i chroni mózg. Właśnie przy takim połączeniu uważni czytelnicy powinni się zatrzymać.

W mózgu występują dwie populacje komórek wspierających o różnych zadaniach, a błękit metylenowy badano w każdej z nich przy użyciu innego bodźca eksperymentalnego. Astrocyty zapewniają wsparcie metaboliczne. Znajdują się między naczyniami krwionośnymi a neuronami, usuwają nadmiar glutaminianu, buforują stężenie potasu, magazynują glikogen i dostarczają neuronom paliwo, gdy zapotrzebowanie gwałtownie rośnie. Mikroglej to rezydujące w tkance komórki nadzoru immunologicznego. Ich cienkie wypustki patrolują tkankę, wykrywają sygnały pochodzenia bakteryjnego i sygnały uszkodzenia, a po uruchomieniu alarmu cofają się, nadając komórce zaokrągloną, ameboidalną postać przystosowaną do migracji i pochłaniania, czemu towarzyszy uwalnianie cząsteczek sygnałowych. Wyniku uzyskanego w jednej populacji nie można przenieść na drugą, a pomiar zastosowany w każdym przypadku decyduje o tym, co rzeczywiście wykazano.

Astrocyty w warunkach stresu metabolicznego: kluczowy jest moment podania

Eksperyment z astrocytami zaczyna się od pozbawienia ich niezbędnych zasobów. Badacze hodowali astrocyty kory mózgowej pobrane od nowo narodzonych myszy, usunęli glukozę i niemal cały tlen na sześć godzin, a następnie przywrócili oba składniki na dwadzieścia cztery godziny. Był to laboratoryjny model udaru z następującą po nim reperfuzją. Gdy błękit metylenowy był obecny w fazie pozbawienia tlenu i glukozy, przeżywalność komórek się pogarszała. Gdy dodawano go wyłącznie w fazie ponownego natlenienia, w stężeniach 0.1 i 1 mikromola na litr, przeżywalność oceniana testem żywotności z kalceiną istotnie się poprawiała. Badanie astrocytów mysich przedstawia tę zależność od momentu podania wraz z danymi dotyczącymi oddychania komórkowego.

To właśnie ta różnica jest najważniejszym wynikiem. W fazie pozbawienia tlenu niemal nie ma cząsteczek tlenu, które mogłyby przyjąć elektrony, więc pośrednik transportu elektronów nie ma dokąd ich przekazać. Podczas ponownego natlenienia mechanizm znów zaczyna działać i barwnik może spełnić swoją rolę. Astrocyty poddane jego działaniu zużywały więcej tlenu, pobierały więcej glukozy, wytwarzały więcej ATP i odbudowywały zapasy glikogenu, przy wyższej aktywności heksokinazy i bez wzrostu ilości mitochondrialnego anionorodnika ponadtlenkowego. Proponowane wyjaśnienie jest znane z omówienia błękitu metylenowego jako mitochondrialnego nośnika elektronów: przenosi on elektrony z pominięciem zablokowanych miejsc w łańcuchu oddechowym, dzięki czemu oddychanie zostaje wznowione sprawnie, zamiast kierować elektrony na tworzenie reaktywnych form.

Warto zwrócić uwagę na rodzaj tych dowodów. To wynik dotyczący przeżywalności i metabolizmu jednego izolowanego typu komórek, z określonym oknem skutecznego działania — fazą regeneracji, a nie pozbawienia zasobów — oraz określonym zakresem stężeń. Nie mówi nic o sygnalizacji immunologicznej ani o zachowaniu.

Mikroglej w obliczu alarmu bakteryjnego: przeprogramowanie metabolizmu

Eksperymenty z mikroglejem zaczynają się od przeciwnego bodźca: nie od głodzenia, lecz od pozornej infekcji. Lipopolisacharyd, fragment zewnętrznej błony bakterii, wiąże się z receptorami odporności wrodzonej i wywołuje w mikrogleju reakcję na obecność patogenów, choć nie ma żadnych żywych bakterii. U myszy, którym podano lipopolisacharyd, oraz w hodowanej linii komórek mikrogleju skutkiem jest dobrze znany program zapalny: wzrasta poziom czynników prozapalnych, mikroglej polaryzuje się w kierunku agresywnego stanu M1, sąsiednie neurony obumierają, a zwierzęta uzyskują gorsze wyniki w zadaniach oceniających uczenie się i pamięć.

Badanie tej odpowiedzi u myszy wskazuje na szlak wykrywania tlenu: lipopolisacharyd nasila nadekspresję PHD3, jednego z trzech enzymów hydroksylazy prolinowej, poprzez poprzedzającą go kaskadę Siah2/Morg1. Jednocześnie komórki przeprogramowują wykorzystanie energii w kierunku glikolizy tlenowej, przy zwiększonym poziomie mitochondrialnych reaktywnych form tlenu. Autorzy mierzyli tę zmianę bezpośrednio za pomocą testów metabolicznych Seahorse, oceniających zużycie tlenu i zakwaszenie środowiska zewnątrzkomórkowego. Błękit metylenowy odwracał zarówno zmianę metaboliczną, jak i nadekspresję PHD3, obniżał poziom czynników zapalnych, ograniczał obumieranie neuronów i poprawiał wyniki testów behawioralnych. Pozytonowa tomografia emisyjna dostarczyła dodatkowych danych obrazowych: lipopolisacharyd zwiększał wychwyt glukozy w hipokampie w badaniu FDG-PET, a po podaniu błękitu metylenowego wychwyt ponownie malał, co było zgodne z mniej nasilonym metabolizmem zapalnym w żywym mózgu.

Jest to bogatszy zestaw pomiarów niż w badaniu astrocytów — obejmuje cytokiny, metabolizm, obrazowanie i zachowanie zwierząt — ale dotyczy innego bodźca i innej komórki. Porównując te dwa badania, należy rozróżniać bodźce: jedno dotyczy ratowania pozbawionych zasobów komórek wspierających w fazie regeneracji, drugie tłumienia fałszywego alarmu infekcyjnego w komórkach odpornościowych.

Mikroglej pod mikroskopem: kształt jako wskaźnik

Trzeci eksperyment analizuje ten sam alarm bakteryjny wyłącznie przez pryzmat kształtu komórek. W hodowlach gleju z kory mózgowej szczura kontrolne komórki mikrogleju barwione na obecność markera IBA1 mają liczne cienkie wypustki, czyli rozgałęzioną postać związaną z nadzorem tkanki. Po dwudziestu czterech godzinach ekspozycji na lipopolisacharyd w stężeniu 10 mikrogramów na mililitr komórki spłaszczają się i przyjmują postać ameboidalną, a powierzchnia ich ciała rośnie, podczas gdy obwód pozostaje mniej więcej stały. Jest to geometryczna oznaka zaokrąglania się komórek. Błękit metylenowy w stężeniu 1 mikromola na litr, podany równocześnie z toksyną, pozwalał zachować rozgałęzione wypustki oraz utrzymywał powierzchnię i obwód ciała komórki blisko wartości kontrolnych. Badanie hodowli komórek szczurzych ilościowo opisuje to zachowanie kształtu na podstawie pomiarów powierzchni i obwodu ciała komórki.

Dwa szczegóły sprawiają, że to badanie wnosi więcej niż sam obraz. Po pierwsze, menadion — związek porównawczy, będący inną cząsteczką aktywną oksydoredukcyjnie, zastosowany w tym samym stężeniu — nie pozwalał zachować kształtu, a sam skłaniał komórki do przyjmowania postaci aktywowanej. Efekt nie jest więc ogólną właściwością wszystkich związków uczestniczących w cyklach oksydoredukcyjnych. Po drugie, autorzy wiążą działanie barwnika z aktywacją Nrf2, czynnika transkrypcyjnego sterującego programem genów antyoksydacyjnych i przeciwzapalnych, a nie wyłącznie z bezpośrednim wychwytywaniem reaktywnych form. Powiązane omówienie sygnalizacji oksydoredukcyjnej i zapalnej umieszcza ten związek z Nrf2 w szerszym kontekście.

Kształt pozostaje jednak najmniej miarodajnym z trzech wskaźników. Rozgałęziona komórka zwykle sprawuje nadzór nad tkanką, a zaokrąglona jest zwykle aktywowana, lecz morfologia jest wskaźnikiem pośrednim, a nie odczytem transkrypcji. W tej hodowli nie było komórek odpornościowych pochodzących z krwi, obwodów neuronalnych ani możliwości oceny zachowania.

Zestawienie trzech wyników

Wspólny wzorzec jest taki, że każdemu bodźcowi odpowiada własny pomiar i własna odpowiedź. Ratowanie metabolizmu odpowiada na pytanie o metabolizm. Dane dotyczące cytokin i zachowania odpowiadają na pytanie o stan zapalny. Kształt odpowiada na pytanie o kształt. Żaden z tych trzech wyników sam w sobie nie rozstrzyga kwestii z pozostałych obszarów.

Czego nie dowodzi spokojniejszy wygląd mikrogleju

Cały ten temat wymaga jednego zdania: mniej aktywowany wygląd mikrogleju lub zmieniony metabolizm jego komórek same w sobie nie dowodzą poprawy funkcjonowania mózgu.

Morfologia może się zmieniać bez towarzyszącej zmiany funkcji. Komórka może zachować wypustki, a nadal uwalniać cytokiny, albo zaokrąglić się, wykonując pożyteczne zadanie usuwania pozostałości komórkowych. Odczyty metaboliczne mają to samo ograniczenie: zapis z aparatu Seahorse lub obraz PET pokazuje gospodarowanie energią, a nie funkcje poznawcze. Badanie na myszach, w którym odczyty metaboliczne i wskaźniki podobne do morfologicznych połączono z testami behawioralnymi, jest mocniejsze właśnie dlatego, że zestawia różne poziomy dowodów, zamiast opierać wniosek na jednym pomiarze. Nawet w nim obowiązują zwykłe ograniczenia: lipopolisacharyd modeluje alarm bez obecności żywych patogenów, a nie rzeczywistą infekcję, myszy nie są ludźmi, a sami autorzy wskazują na różnice międzygatunkowe. Każdy, kto planuje dalsze badania, powinien rozważyć, jak wyniki dotyczące mikrogleju przekładają się między modelami, zanim założy, że szlak zachowuje się identycznie w tkance ludzkiej.

Wynika z tego praktyczny wniosek dotyczący momentu podania. W badaniu astrocytów wczesne podanie pogarszało wynik, natomiast podanie w fazie regeneracji go poprawiało. Wyniki dotyczące mikrogleju uzyskano przy podawaniu w okresie zbliżonym do zadziałania bodźca zapalnego. Rzeczywiste uszkodzenie mózgu łączy obie fazy naraz: zaburzenie zaopatrzenia w energię i alarm immunologiczny, rozwijające się przez wiele godzin. Eksperyment izolujący jedną fazę nie może wyznaczyć harmonogramu podawania dla sytuacji, w której obie występują razem. Dlatego w dyskusjach o oknach podawania rozpatruje się osobno przebieg pozbawienia zasobów i przebieg stanu zapalnego.

Rzetelne podsumowanie mieści się w jednym akapicie. W izolowanych astrocytach błękit metylenowy podany podczas ponownego natlenienia przywraca oddychanie komórkowe i ratuje komórki. W mikrogleju poddanym działaniu fragmentu bakterii odwraca zapalny program metaboliczny poprzez określony szlak PHD3 i zachowuje postać spoczynkową. Każdy wynik jest rzeczywisty w warunkach danego eksperymentu, ale żaden nie stanowi ogólnego rozstrzygnięcia dotyczącego stanu zapalnego w mózgu. Porównanie komórek glejowych jest przydatne właśnie dlatego, że nie pozwala zlać się tym dwóm historiom w jedną.