Błękit metylenowy a stłuszczenie wątroby: co wykazały badania eksperymentalne

Stłuszczenie wątroby to jedna nazwa obejmująca kilka różnych problemów. U jednej osoby czynnikiem wyzwalającym jest długotrwałe spożywanie dużych ilości alkoholu. U innej — nadmierna podaż składników odżywczych, insulinooporność i zwiększony dopływ tłuszczu do wątroby. W obu przypadkach pod mikroskopem może być widoczne zwykłe gromadzenie tłuszczu, ale przyczyny leżące u podstaw tego procesu są różne. Ta różnica decyduje o tym, czego może dowieść dany eksperyment.

Literatura dotycząca błękitu metylenowego i stłuszczenia wątroby jest skromna i w tym zakresie obejmuje wyłącznie badania przedkliniczne. Najczęściej cytuje się trzy badania na szczurach i myszach, których wyniki nie są zgodne. W jednym badaniu z podawaniem etanolu skorygowano zmianę stanu redoks, ale ilość tłuszczu w wątrobie pozostała niezmieniona. W jednym badaniu z dietą wysokotłuszczową zmniejszeniu ilości tłuszczu w wątrobie towarzyszyła zmiana sygnalizacji. W jednym badaniu na zdrowych zwierzętach uzyskano przeciwne wyniki peroksydacji lipidów w wątrobie i nerkach. Rozpatrywane łącznie pokazują, dlaczego trzy punkty końcowe należy traktować oddzielnie: zmianę stanu redoks, aktywację sygnalizacji i gromadzenie tłuszczu w tkance.

Trzy punkty końcowe, które łatwo pomylić

Parametr redoks opisuje przemiany związane z elektronami. Stosunek NAD+ do NADH w wątrobie wskazuje, czy środowisko komórkowe jest względnie utlenione, czy zredukowane. Utlenianie etanolu przekształca NAD+ w NADH, dlatego przewlekłe picie alkoholu obniża ten stosunek. Barwnik przyjmujący elektrony może go ponownie zwiększyć. To zjawisko chemiczne, a nie dowód na zmniejszenie ilości zgromadzonego tłuszczu.

Parametr sygnalizacji opisuje regulację. SIRT1 to zależny od NAD+ enzym regulacyjny, który modyfikuje białka uczestniczące w funkcjonowaniu mitochondriów i przemianach lipidów. AMPK działa jako czujnik niskiego poziomu energii: po aktywacji sprzyja utlenianiu substratów energetycznych i ogranicza syntezę lipidów. Gdy publikacja opisuje aktywację SIRT1 w wątrobie pod wpływem błękitu metylenowego, opisuje zmianę regulacji. Nie jest to jeszcze wynik dotyczący pacjenta.

Parametr histologiczny lub biochemiczny opisuje samą wątrobę. Typowe przykłady to zawartość triglicerydów na gram tkanki, barwienie tłuszczu obojętnego metodą Oil Red O, ocena zwyrodnienia balonowatego i uszkodzeń w barwieniu hematoksyliną i eozyną oraz aktywność ALT w osoczu. Tylko ta trzecia kategoria odpowiada na pytanie, czy w danym eksperymencie stłuszczenie wątroby zmniejszyło się pod wpływem błękitu metylenowego.

Rozdzielanie tych kategorii zapobiega najczęstszej błędnej interpretacji: korzystny wynik dotyczący redoks lub sygnalizacji nie oznacza mniejszego stłuszczenia wątroby.

Model etanolowy: skorygowany stan redoks, niezmieniona ilość tłuszczu

Najbardziej jednoznaczny wynik negatywny pochodzi z badania przewlekłego podawania etanolu w diecie samcom szczurów Wistar. Zwierzęta otrzymywały etanol jako składnik płynnej diety, a jego udział zwiększano do 36 procent całkowitej wartości energetycznej. Zwierzęta kontrolne, otrzymujące dopasowane ilości pokarmu, dostawały glukozę zamiast energii pochodzącej z etanolu. Jedna grupa otrzymująca etanol i jedna grupa kontrolna dostawały również błękit metylenowy w ilości 130 mg na litr diety, czyli około 42 mg na kg dziennie, od dnia 5 do dnia 30.

Stan redoks oszacowano na podstawie standardowych par metabolitów: stosunku mleczanu do pirogronianu dla cytozolu oraz 3-hydroksymaślanu do acetooctanu dla mitochondriów. We wczesnym okresie podawania dużych dawek etanolu w grupach etanolowych wystąpiły znaczne zmiany: stosunek NAD+ do NADH w cytozolu spadł o około 62 procent, a w mitochondriach o około 71 procent; wzrósł też poziom glicerolo-3-fosforanu. Błękit metylenowy w dużej mierze odwrócił te zmiany i przywrócił poziom glicerolo-3-fosforanu do wartości zbliżonych do kontrolnych, nie zmieniając spożycia etanolu, przyrostu masy ciała ani stężenia etanolu w surowicy.

Wyniki dotyczące tłuszczu w wątrobie wyglądały inaczej. W dniu 12, przed znacznym nagromadzeniem tłuszczu, zawartość triglicerydów nie różniła się między grupami. W dniu 27 w grupach etanolowych wystąpił duży wzrost zawartości triglicerydów, niezależnie od podawania błękitu metylenowego. W dniu 30 u zwierząt otrzymujących etanol całkowita zawartość lipidów wzrosła o około 89 procent, a triglicerydów o około 196 procent — ponownie bez wpływu barwnika. Stłuszczenie w centralnych częściach zrazików wyglądało tak samo z podawaniem błękitu metylenowego i bez niego. Autorzy uznali, że zmiana stanu redoks wywołana etanolem nie jest główną przyczyną stłuszczenia wątroby po długotrwałym podawaniu etanolu w tym modelu. Pomaga tu umiejętność rozróżniania, jak wyniki badań na zwierzętach i komórkach przekładają się na ryzyko u ludzi: mechanizm może rzeczywiście istnieć, a mimo to nie decydować o wyniku.

To badanie warto przywołać, gdy ktoś twierdzi, że każda korekta stanu redoks musi usunąć tłuszcz z wątroby. W tym układzie eksperymentalnym tak się nie stało.

Model metaboliczny: sygnalizacja i mniej tłuszczu u myszy

Inny obraz wyłania się z badania hepatocytów i myszy na diecie wysokotłuszczowej, skoncentrowanego na SIRT1 i AMPK. W komórkach HepG2, komórkach AML-12 oraz pierwotnych hepatocytach szczurzych błękit metylenowy zwiększał stosunek NAD+ do NADH, podnosił poziom białka SIRT1, zmniejszał acetylację regulatora PGC-1alpha, zwiększał zawartość mitochondrialnego DNA i zużycie tlenu oraz aktywował AMPK, czemu towarzyszył wzrost poziomu CPT-1 i PPARalpha na dalszych etapach szlaku. Po wyciszeniu SIRT1 aktywacja AMPK zanikała, co wiąże ten ciąg zdarzeń z SIRT1 w tym układzie komórkowym. Barwnik przeciwdziałał również sygnałom lipogennym wywołanym przez agonistę LXR T0901317 oraz ekspozycję na palmitynian, w tym indukcji SREBP-1c, FAS i ACC.

W części zwierzęcej wykorzystano samce myszy C57BL/6 karmione dietą zawierającą 60 procent tłuszczu przez 8 tygodni. W ostatnich 4 tygodniach błękit metylenowy podawano doustnie cztery razy w tygodniu w dawce 3 lub 10 mg na kg dziennie. U myszy otrzymujących barwnik stwierdzono słabsze barwienie Oil Red O, mniejszą zawartość triglicerydów w wątrobie, mniej nasilone zwyrodnienie balonowate i stłuszczeniowe w badaniu histologicznym oraz niższą aktywność ALT w osoczu niż u myszy na diecie wysokotłuszczowej, które nie otrzymywały barwnika. Badania farmakokinetyczne opisane w tej samej publikacji wykazały biodostępność po podaniu doustnym na poziomie około 31 do 35 procent, przy niemal całkowitym wchłanianiu z jelit, ale znacznym metabolizmie. Najwyższy stosunek stężenia w tkance do stężenia w osoczu stwierdzono w wątrobie, co przynajmniej pod względem dystrybucji czyni wpływ na wątrobę prawdopodobnym.

To rzeczywisty sygnał zmniejszenia stłuszczenia, ale o wąskim zakresie. Jest to krótkie badanie na myszach, obejmujące 9 do 10 zwierząt w grupie, jedną dietę, dwie dawki i cztery tygodnie podawania barwnika. Ocenia stłuszczenie metaboliczne i cechy stłuszczeniowego zapalenia wątroby, a nie chorobę związaną z alkoholem. Nie bada też marskości, cofania się włóknienia ani żadnych wyników u ludzi. Pomiary mitochondrialne i redoks pomagają interpretować takie wyniki jako wsparcie dla hipotezy, a nie jako podstawę dawki czy protokołu.

Obraz zdrowych tkanek: ta sama dawka, przeciwne wyniki w narządach

Trzecie badanie często przywołuje się w twierdzeniach dotyczących wątroby, których nie uzasadnia. W 30-dniowym eksperymencie na zdrowych samicach szczurów Wistar pięć zwierząt otrzymywało błękit metylenowy o stężeniu 1 mM w wodzie do picia, a pięć stanowiło grupę kontrolną. Dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i zredukowany glutation nie zmieniły się w wątrobie ani nerkach. Peroksydacja lipidów nieznacznie wzrosła w wątrobie i spadła w nerkach. Aktywność ALT i stężenie kreatyniny w surowicy zmniejszyły się, bez zmiany stężenia azotu mocznikowego we krwi.

Rzetelna interpretacja wskazuje na swoistość tkankową u zdrowych zwierząt, a nie leczenie choroby. Według jednego markera ta sama ekspozycja miała łagodnie prooksydacyjny charakter w wątrobie, a według tego samego markera — łagodnie ochronny w nerkach, podczas gdy standardowe mechanizmy obrony antyoksydacyjnej pozostały bez zmian. Przy pięciu zwierzętach w grupie i braku modelu choroby publikacja ta przestrzega przed nazywaniem błękitu metylenowego uniwersalnym antyoksydantem wątrobowym. Pokazuje też, dlaczego zmiany aktywności enzymów wątrobowych wymagają określonego kontekstu chorobowego, zanim można je uznać za poprawę.

Porównanie trzech eksperymentów dotyczących wątroby

Tabela uwidacznia główny wniosek. Podobny niebieski barwnik, odmienna biologia. Badanie etanolowe oddziela poprawę stanu redoks od braku zmniejszenia ilości tłuszczu. Badanie dietetyczne łączy zmiany sygnalizacji i zmniejszenie ilości tłuszczu w jednym modelu. Badanie na zdrowych zwierzętach pokazuje, że markery redoks mogą zmieniać się w przeciwnych kierunkach zależnie od narządu.

Dlaczego nie wynika z tego twierdzenie o leczeniu

W żadnym z tych badań nie uczestniczyli ludzie ze stłuszczeniem wątroby. Dawki, drogi podania i czas trwania różnią się między publikacjami i nie można ich przeliczyć na schemat stosowania u ludzi przez proste skalowanie. Małe liczebności grup, zwłaszcza trzy zwierzęta na punkt czasowy pomiarów redoks w badaniu etanolowym i pięć na grupę w badaniu na zdrowych zwierzętach, pozostawiają znaczną niepewność. Różnią się też płeć, szczep, skład diety i moment rozpoczęcia podawania względem wystąpienia uszkodzenia. Ponadto oba modele chorobowe odzwierciedlają odmienne przyczyny wyjściowe, więc pozytywny wynik badania dietetycznego nie unieważnia negatywnego wyniku badania etanolowego ani odwrotnie.

Dla osoby z rozpoznaną chorobą wątroby ważniejsze są informacje o środkach ostrożności niż o potencjale terapeutycznym. Przegląd środków ostrożności dotyczących nerek i wątroby przy stosowaniu błękitu metylenowego wyjaśnia, dlaczego upośledzenie czynności narządów zmienia kwestie bezpieczeństwa, nawet gdy wyniki badania na zwierzętach wyglądają korzystnie. Przedstaw lekarzowi rozpoznanie, ostatnie wyniki badań laboratoryjnych, dokładny produkt i drogę podania oraz pełną listę leków. Zapytaj, jakie dowody uzasadniają stosowanie tego produktu w tym celu u osoby z takim stopniem upośledzenia czynności narządu.

Podsumowując: błękit metylenowy zmienił stan redoks wątroby w jednym modelu etanolowym bez zmniejszenia ilości zgromadzonego tłuszczu, aktywował SIRT1 i AMPK przy jednoczesnym zmniejszeniu ilości tłuszczu w jednym mysim modelu metabolicznym oraz wykazał zależne od narządu działanie redoks u zdrowych szczurów. To zestaw wskazówek do dalszych badań, a nie uznana metoda leczenia stłuszczenia wątroby.