Barwienie proste błękitem metylenowym a barwienie metodą Grama: co można wykazać każdą z tych metod

Student przygotowuje rozmaz z hodowli oznaczonej jako E. coli, zalewa go błękitem metylenowym na jedną minutę, płucze i ogląda przez obiektyw immersyjny. Niebieskie pałeczki wypełniają pole widzenia. W sprawozdaniu zapisuje: „Pałeczki Gram-ujemne zidentyfikowane jako E. coli”. Obserwacja jest poprawna. Sam preparat nie uzasadnia jednak tego wniosku.

Błąd dotyczy rozumienia metody, a nie techniki wykonania. Student potraktował barwienie proste tak, jakby było testem różnicującym. Barwienie proste i barwienie metodą Grama odpowiadają na różne pytania, ponieważ opierają się na różnych zasadach. Pierwsze pozwala ustalić, jaki kształt mają komórki. Drugie sprawdza, jak ściana komórkowa zachowuje się pod wpływem określonych odczynników. Pomylenie tych metod sprawia, że poprawnie wybarwiony preparat prowadzi do nieuzasadnionego opisu wyniku.

To porównanie wyraźnie rozdziela obie metody, pokazuje, jakie wnioski można wyciągnąć z ich wyników, i odpowiada na dwa najczęstsze pytania studentów: czy błękit metylenowy można stosować w barwieniu metodą Grama oraz co faktycznie pokazuje barwienie E. coli błękitem metylenowym.

Krótka odpowiedź

Barwienie proste błękitem metylenowym nadaje wszystkim komórkom przyjmującym barwnik ten sam niebieski kolor. Uwidacznia więc morfologię (pałeczki, kuliste komórki, spirale) i układ (pojedyncze komórki, pary, łańcuszki), ale nie określa kategorii Grama. Barwienie metodą Grama obejmuje dodatkowo jod, etap odbarwiania i barwnik kontrastowy. Rozdziela zatem bakterie na Gram-dodatnie (fioletowe) i Gram-ujemne (różowe lub czerwone) na podstawie tego, jak ich osłony komórkowe zatrzymują barwnik. Niebieskie pałeczki po zastosowaniu błękitu metylenowego oznaczają: „obecne są komórki o kształcie pałeczek”. Różowe pałeczki po pełnej procedurze Grama oznaczają: „obecne są pałeczki Gram-ujemne”. Drugie stwierdzenie pozwala wnioskować więcej, ponieważ procedura obejmowała dodatkowy test.

Szerszą grupę metod barwienia bakterii jednym barwnikiem, do której należy metoda omawiana w tym artykule, przedstawia atlas barwienia w mikroskopii.

Barwienie proste: jeden barwnik, jedno pytanie

Błękit metylenowy jest barwnikiem zasadowym (kationowym). Jego barwny jon ma ładunek dodatni i wiąże się z ujemnie naładowanymi strukturami komórki, w tym z kwasami nukleinowymi i kwasowymi grupami na powierzchni. Dlatego komórki są widoczne jako niebieskie na jasnym tle. OpenStax opisuje tę zasadę barwienia pozytywnego w rozdziale o barwieniu. Sam kation barwnika jest małym, płaskim jonem fenotiazynowym opisanym szczegółowo w opracowaniu dotyczącym chemii błękitu metylenowego; przeciwjon chlorkowy nie odpowiada za barwienie.

Standardowy protokół dydaktyczny jest celowo prosty: przygotować cienki rozmaz, wysuszyć na powietrzu, utrwalić termicznie, zalać około 1% wodnym roztworem błękitu metylenowego na mniej więcej jedną minutę, delikatnie opłukać wodą, osuszyć przez przykładanie bibuły i obejrzeć z użyciem immersji olejowej. Protokół dydaktyczny LibreTexts podaje dokładnie ten wariant: 1% roztwór i jedna minuta, zaznaczając jednocześnie, że niektóre laboratoria wydłużają czas barwienia. Bez zaprawy, bez odbarwiacza, bez drugiego barwnika. Właśnie ten brak jest istotą metody. Przy jednym barwniku i bez jego selektywnego usuwania każda komórka, która go wiąże, ostatecznie ma ten sam kolor.

W przypadku E. coli spodziewany obraz to niebieskie pałeczki, występujące pojedynczo, parami lub w niewielkich skupiskach. Niebieski kolor pochodzi od barwnika. Kształt pałeczki jest cechą mikroorganizmu. Jednak połączenie tych cech nie pozwala zidentyfikować mikroorganizmu, ponieważ wiele gatunków ma kształt pałeczek i wiele pałeczek w barwieniu prostym wybarwia się na niebiesko. ATCC wyraźnie wskazuje w swoim przewodniku po hodowlach mikrobiologicznych, że metoda ogranicza się do oceny morfologii. Poprawny opis wyniku brzmi: „zaobserwowano niebieskie pałeczki”. Wnioski wykraczające poza kształt i układ komórek wymagają dodatkowych dowodów.

Barwienie metodą Grama: cztery odczynniki, jeden test zachowania komórek

Barwienie metodą Grama jest barwieniem różnicującym. Wszystkie komórki poddaje się tej samej sekwencji czynności i sprawdza, które zatrzymują pierwszy barwnik, a które go tracą. Protokoły barwienia metodą Grama American Society for Microbiology określają standardową kolejność czterech etapów: fiolet krystaliczny (barwnik podstawowy), płyn Lugola (zaprawa), alkohol lub mieszanina acetonu z alkoholem (odbarwiacz), a następnie safranina (barwnik kontrastowy).

Standardowy model dydaktyczny wyjaśnia to rozróżnienie budową osłon komórkowych. Komórki Gram-dodatnie mają grubą ścianę peptydoglikanową, która podczas płukania alkoholem ulega odwodnieniu i zatrzymuje kompleks fioletu krystalicznego z jodem. Komórki Gram-ujemne mają cienką warstwę peptydoglikanu oraz bogatą w lipidy błonę zewnętrzną, którą narusza odbarwiacz. W efekcie kompleks zostaje wypłukany, a komórki następnie przyjmują safraninę. Przegląd barwienia metodą Grama w NCBI Bookshelf przedstawia to wyjaśnienie oparte na budowie ściany komórkowej. Specjaliści dodają, że pełny opis fizykochemiczny jest bardziej złożony niż sama grubość ściany. Jednak przy interpretacji wyniku w laboratorium obowiązuje ta sama zasada: fiolet oznacza zatrzymanie barwnika, a róż — jego utratę i późniejsze przyjęcie barwnika kontrastowego.

Panele poglądowe. Stylizowane rysunki do porównania metod, nie mikrofotografie wykonane aparatem. Kolory uproszczono, aby wyjaśnić zasadę: jeden kolor w barwieniu prostym, dwa kolory po etapie odbarwiania w metodzie Grama.

Czy błękit metylenowy można stosować w barwieniu metodą Grama

To pytanie można rozumieć na dwa sposoby, które wymagają różnych odpowiedzi.

Pierwsza interpretacja: czy jednorazowe zalanie preparatu błękitem metylenowym może zastąpić całą procedurę Grama. Nie. Bez jodu, odbarwiacza i barwnika kontrastowego nie ma etapu różnicującego, więc nie bada się kategorii Grama. Niebieskie pole po zastosowaniu samego błękitu metylenowego jest wynikiem barwienia prostego, nawet jeśli butelka stoi obok odczynników do metody Grama. Nie należy zapisywać go jako wyniku barwienia metodą Grama.

Druga interpretacja: czy błękit metylenowy może zastąpić safraninę jako barwnik kontrastowy w etapie 4. Pod względem funkcji może wybarwić odbarwione komórki, a w podręcznikowym ćwiczeniu przewiduje się po takiej zamianie fioletowe komórki Gram-dodatnie i niebieskie komórki Gram-ujemne. To rozumowanie jest poprawne, ponieważ prawidłowo odbarwione komórki Gram-ujemne są niemal bezbarwne i przyjmą inny barwnik kationowy. Nie jest to jednak standardowy protokół. Protokoły ASM wskazują safraninę, z uznanymi zamiennikami, takimi jak fuksyna zasadowa w niektórych wariantach, ale nie błękit metylenowy. Istnieje też praktyczna wada: niebieski trudniej odróżnić od fioletowego niż różowy od fioletowego, zwłaszcza początkującym i szczególnie przy słabych, zużytych lampach mikroskopowych. W ćwiczeniach dydaktycznych i wszędzie tam, gdzie wynik ma znaczenie, należy stosować barwnik kontrastowy wskazany w protokole, zwykle safraninę. Barwienie kontrastowe błękitem metylenowym należy traktować jako wariant demonstracyjny, a nie równoważny standard.

Powiązane pytanie o porównanie błękitu metylenowego z innymi metodami wykorzystującymi pojedynczy barwnik omówiono w porównaniu metod barwienia prostego bakterii.

Co wykazuje barwienie E. coli błękitem metylenowym, a czego nie wykazuje

E. coli jest pałeczką Gram-ujemną, ale to zdanie łączy informacje uzyskane różnymi metodami: morfologię z mikroskopii, reakcję Grama z barwienia metodą Grama, a tożsamość z hodowli oraz badań biochemicznych lub molekularnych. Rozmaz barwiony błękitem metylenowym dostarcza tylko pierwszej części tych informacji. Pozwala ustalić, że w wybarwionej próbce są obecne komórki o kształcie pałeczek, i określić ich układ. Nie ustala reakcji Grama, ponieważ nie przeprowadzono próby odbarwiania. Nie identyfikuje gatunku, ponieważ przy tej rozdzielczości pałeczki wielu gatunków wyglądają podobnie.

W tym miejscu w sprawozdaniach pojawia się przewidywalny błąd. Autor przenosi wiedzę ogólną („ta hodowla ma zawierać E. coli, a E. coli jest Gram-ujemna”) do opisu obserwacji, przez co preparat pozornie potwierdza coś, co w rzeczywistości tylko założono. Bardziej przejrzysty opis rozdziela te poziomy: „Barwienie proste błękitem metylenowym: zaobserwowano niebieskie pałeczki; oceniono wyłącznie morfologię, nie badano kategorii Grama”. Następnie, jeśli barwienie metodą Grama wykonano poprawnie z użyciem kontroli: „Barwienie metodą Grama: różowe pałeczki, obraz zgodny z reakcją Gram-ujemną”. Identyfikacja gatunku następuje później, na podstawie procedury identyfikacyjnej, a nie samego koloru.

Praktyczny przewodnik interpretacji

Przy pracy laboratoryjnej stosuj następującą zasadę. Jeśli wszystkie komórki mają jeden kolor, a w protokole użyto jednego barwnika bez odbarwiacza, wykonano barwienie proste. Opisz kształt, szacunkową wielkość i układ komórek. Na tym zakończ. Jeśli w protokole zastosowano fiolet krystaliczny, jod, odbarwiacz i barwnik kontrastowy wraz ze znanymi kontrolami dodatnimi i ujemnymi, wykonano barwienie metodą Grama. Opisz kolor i morfologię: fioletowe ziarniaki w łańcuszkach, różowe pałeczki i tak dalej.

Za większość nieporozumień odpowiadają trzy błędy. Po pierwsze, uznawanie niebieskich pałeczek za potwierdzenie obecności E. coli. Po drugie, zapisywanie preparatu barwionego błękitem metylenowym w notatniku pod nagłówkiem „barwienie metodą Grama”, co późniejsi czytelnicy błędnie zinterpretują. Po trzecie, dowolne zamienianie barwników kontrastowych, a następnie porównywanie kolorów między laboratoriami tak, jakby stosowano w nich tę samą paletę. Rozwiązanie każdego z tych problemów jest takie samo: nazwij metodę, którą rzeczywiście wykonano, i formułuj wyłącznie wnioski dotyczące tego, co ta metoda bada.

Barwienie proste jest przydatne właśnie dlatego, że pozwala wyciągać tylko ograniczone wnioski. Jest szybkie, wybacza drobne niedoskonałości wykonania i wystarcza, gdy pytanie dotyczy morfologii: czy są obecne komórki i jaki mają kształt. Gdy pytanie dotyczy klasyfikacji, przeprowadź test różnicujący. Niebieski preparat mówi, jak wyglądają komórki. Fioletowy lub różowy preparat mówi, jak zachowują się ich ściany. Żaden z tych preparatów sam w sobie nie wskazuje gatunku.