Alkaliczny błękit metylenowy Loefflera i polichromatyczny błękit metylenowy — wyjaśnienie

Na stanowisku do barwienia mogą stać obok siebie trzy butelki, każda opisana jako jakiś wariant błękitu metylenowego. Na jednej widnieje napis: wodny roztwór błękitu metylenowego 1%. Na drugiej: alkaliczny błękit metylenowy Loefflera. Na trzeciej: polichromatyczny błękit metylenowy. Zabiegany pracownik sięga po tę, która stoi najbliżej. Rozmaz barwi się potem zbyt słabo, zbyt jednolicie na niebiesko albo przybiera nieoczekiwane odcienie fioletu, a winą za wynik obarcza się próbkę.

To problem składu roztworu, a nie próbki. Te trzy roztwory zawierają pokrewne barwniki, ale opierają się na różnych zasadach barwienia. Jeden jest zwykłym barwnikiem kationowym o pH zbliżonym do obojętnego. Drugi zawiera ten sam barwnik, którego działanie nasila dodatek zasady. Trzeci nie jest już pojedynczym barwnikiem, lecz celowo utlenioną mieszaniną. Wybór niewłaściwego roztworu zmienia zasadę barwienia w trakcie pracy.

Krótka odpowiedź

Zwykły wodny roztwór błękitu metylenowego to punkt odniesienia: około 1% barwnika w wodzie, prosty barwnik kationowy do oceny morfologii bakterii i ogólnych zastosowań mikroskopowych. Alkaliczny błękit metylenowy Loefflera powstaje przez dodanie niewielkiej, odmierzonej ilości rozcieńczonej zasady do alkoholowego roztworu wyjściowego rozcieńczonego wodą. Podnosi to pH i nasila wiązanie barwnika kationowego z kwaśnymi strukturami bakterii. Polichromatyczny błękit metylenowy to błękit metylenowy poddany celowemu dojrzewaniu przez utlenianie w środowisku zasadowym. Butelka zawiera więc mieszaninę demetylowanych homologów (azure A, azure B, azure C), tioniny i fioletu metylenowego wraz z pozostałością błękitu metylenowego, a mieszanina ta barwi różne struktury na różne odcienie.

Jeśli masz zapamiętać tylko jedno zdanie: alkalizacja zmienia intensywność barwienia, a polichromatyzacja zmienia uzyskiwane kolory.

Zwykły wodny roztwór błękitu metylenowego: punkt odniesienia

Najprostsza receptura to błękit metylenowy rozpuszczony w wodzie, zwykle w stężeniu 1% w/v, bez dodatku zasady i bez utleniania. Barwną formą jest kation metylotioniniowy z chlorkowym przeciwjonem — niewielki, płaski barwnik fenotiazynowy, opisany we wpisie dotyczącym błękitu metylenowego w PubChem jako chlorek metylotioniniowy. Jako kation wiąże się ze szkieletem fosforanowym kwasów nukleinowych oraz z kwaśnymi grupami na ścianach komórkowych bakterii, barwiąc komórki na niebiesko na jasnym tle.

Jego zaletą jest przewidywalność. Jądra komórkowe i bakterie są niebieskie. Kontrast jest umiarkowany. Słabo widoczne drobnoustroje mogą barwić się słabo — właśnie to ograniczenie Loeffler chciał przezwyciężyć. Szerszą grupę prostych barwników bakteryjnych, do której należy ten roztwór, omawia przegląd prostego barwienia bakterii. Także tutaj ważne jest jednoznaczne ustalenie tożsamości substancji: błękit metylowy to zupełnie inna cząsteczka, jak wyjaśnia artykuł błękit metylowy a błękit metylenowy. Wyszukiwanie w katalogu wyłącznie według nazwy koloru może więc prowadzić do wyboru niewłaściwej klasy barwnika.

Alkaliczny błękit metylenowy Loefflera: ten sam barwnik, silniejsze działanie

Klasyczna receptura Loefflera łączy alkoholowy roztwór wyjściowy błękitu metylenowego z rozcieńczonym wodnym roztworem zasady. Wersje podręcznikowe przewidują 0.3 g barwnika w 30 mL 95% etanolu oraz 100 mL 0.01% wodnego roztworu wodorotlenku potasu (lub równoważnie 30 mL nasyconego alkoholowego roztworu błękitu metylenowego, 100 mL wody destylowanej i 1 mL 1% KOH). Daje to roztwór roboczy o stężeniu barwnika bliskim 0.3% i wyraźnie zasadowym pH. Wersje komercyjne opierają się na tej samej zasadzie, a katalog barwników mikrobiologicznych Thermo Fisher wymienia alkaliczny błękit metylenowy Loefflera obok wariantów polichromatycznych i wodnych jako odrębne pozycje katalogowe o różnych zastosowaniach.

Kluczowe znaczenie ma zasada. Podwyższenie pH powoduje deprotonację grup karboksylowych i fosforanowych w preparacie, zwiększając gęstość miejsc o ładunku ujemnym. Jednocześnie alkoholowy roztwór wyjściowy utrzymuje barwnik w pełni rozpuszczony, dzięki czemu dociera on do tych miejsc w postaci monomerów. Efektem jest szybsze i intensywniejsze barwienie bakterii niż w obojętnym roztworze wodnym, z charakterystycznymi ciemnoniebieskimi pałeczkami i ziarniakami typowego rozmazu bakteriologicznego. Barwienie trwa zwykle od jednej do trzech minut, po czym preparat płucze się wodą.

Klasycznym zastosowaniem jest barwienie Corynebacterium diphtheriae hodowanego na podłożu surowiczym Loefflera: smukłych, często maczugowatych pałeczek z silnie wybarwionymi metachromatycznymi ziarnistościami Babesa-Ernsta, zawierającymi zapasowy polifosforan. Powiązanie podłoża z barwnikiem ma charakter historyczny — oba przypisuje się temu samemu bakteriologowi — a kontrastowe uwidocznienie ziarnistości stanowi korzyść diagnostyczną. Poza badaniami dotyczącymi błonicy barwnik służy do ogólnego barwienia bakteriologicznego rozmazów z hodowli, oceny morfologii Neisseria w rozmazach klinicznych oraz wszędzie tam, gdzie barwienie metodą Grama nie jest potrzebne, ale zwykły wodny roztwór błękitu daje zbyt słabe wybarwienie. Jest to barwienie monochromatyczne. Wszystkie kwaśne struktury przybierają jakiś odcień niebieskiego. Gdy protokół wymaga różnicowania kolorystycznego, sama zasada nie może go zapewnić.

Jedna praktyczna uwaga: zasadowe roztwory barwników pogarszają swoje właściwości i wytrącają osad podczas przechowywania oraz pochłaniania dwutlenku węgla. Laboratoria przygotowują więc niewielkie objętości lub kupują gotowy roztwór katalogowy i przestrzegają jego terminu przydatności, zamiast podtrzymywać w użyciu starą butelkę, z której na każde szkiełko trafia już osad.

Polichromatyczny błękit metylenowy: jedna nazwa, kilka barwników

Polichromatyczny błękit metylenowy powstaje z tego samego barwnika, ale jest on poddawany kontrolowanemu utlenianiu w środowisku zasadowym, historycznie nazywanemu dojrzewaniem lub polichromatyzacją. Starzenie w środowisku zasadowym, ogrzewanie z węglanem lub utlenianie za pomocą takich środków jak dichromian stopniowo usuwa grupy metylowe z podstawników dimetyloaminowych. Produktem jest mieszanina: pozostałość błękitu metylenowego oraz azure B (po utracie jednej grupy metylowej), azure A i azure C (po dalszej demetylacji), tionina (całkowicie zdemetylowana) i uboczne produkty utleniania z rodziny fioletu metylenowego. Każdy składnik ma własny odcień i powinowactwo do tkanek, dlatego mieszanina barwi metachromatycznie: jądra komórkowe, ziarnistości, mucyny i chrząstka przybierają różne odcienie od niebieskiego do czerwonofioletowego.

To ta sama chemia, która leży u podstaw słynnych metod barwienia krwi. Pierwsi badacze odkryli, że alkalizowany błękit metylenowy barwi jądra pasożytów malarii na odcienie fioletu, ale ich wodne roztwory po dojrzewaniu były niestabilne i wytrącały osad w ciągu kilku dni. Przegląd opisujący, jak wynaleziono fioletowe barwienie krwi, przedstawia, jak Malachowski i Romanowsky niezależnie wykorzystali ten efekt w 1891 roku, jak wprowadzono metanol w celu stabilizacji osadu barwnika i utrwalania rozmazów bez ogrzewania oraz jak Giemsa później ustandaryzował mieszaninę opartą na odmierzonych ilościach azure B i eozyny, stabilizowaną glicerolem. Współczesne barwniki typu Giemsy wywodzą się bezpośrednio z polichromatycznego błękitu metylenowego połączonego z eozyną — kombinacji wywołującej efekt Romanowsky'ego. Szczegóły dotyczące połączenia z eozyną i składnika azure B znajdziesz w artykule barwniki typu Romanowsky'ego i oddziaływanie azure B z eozyną.

Ponieważ polichromatyczny błękit metylenowy jest mieszaniną, z natury jest najmniej ustandaryzowanym z tych trzech roztworów. Dokładna równowaga jego odcieni zależy od sposobu i stopnia utlenienia. Dlatego dostawcy odczynników histologicznych sprzedają go jako odrębny produkt z własnymi badaniami właściwości użytkowych, a nie jako starzony barwnik Loefflera. Typowe zastosowania obejmują metachromatyczne uwidacznianie ziarnistości komórek tucznych, mucyn i chrząstki, szczegółów komórek plazmatycznych oraz Helicobacter pylori w skrawkach tkankowych za pomocą polichromatycznych metod typu Goodpasture'a. To właściwy wybór, gdy celem jest różnicowanie za pomocą koloru, i niewłaściwy, gdy protokół wymaga wyraźnego, monochromatycznego zarysu bakterii.

Porównanie składu i przeznaczenia

Traktuj tabelę jako schemat podejmowania decyzji. Jeśli preparat barwi się zbyt słabo, zmień podejście do pH i sięgnij po barwnik Loefflera. Jeśli wszystko się barwi, ale nic nie odróżnia się od reszty, zmień rodzaj barwnika i sięgnij po wariant polichromatyczny. Jeśli w rozmazie barwionym metodą Loefflera ziarnistości są pięknie widoczne, ale przełożony pyta, dlaczego jądra i cytoplazma mają ten sam niebieski kolor, odpowiedź brzmi: żaden zasadowy barwnik monochromatyczny nie potrafi ich w ten sposób rozróżnić. To zadanie dla rodziny barwników polichromatycznych i jej pochodnych do barwienia krwi.

Jak unikać typowych pomyłek

Za większość nieporozumień odpowiadają dwa błędy. Pierwszym jest traktowanie barwnika Loefflera jako zamiennika zwykłego błękitu metylenowego, ponieważ oba wyglądają w butelce na niebieskie. Różnią się pH i intensywnością barwienia, a zastąpienie barwnika Loefflera barwnikiem obojętnym powoduje utratę właśnie tego kontrastu ziarnistości, dla którego opracowano protokół. Drugim błędem jest uznawanie dowolnego starego lub przypadkowo postarzonego zasadowego roztworu błękitu za polichromatyczny. Niekontrolowane starzenie daje mieszaninę o nieznanym składzie i nieznanej sile barwienia, podczas gdy właściwe roztwory polichromatyczne przygotowuje się przez określone procesy utleniania, a w rodzinie barwników krwi łączy się je z odmierzoną ilością eozyny. Historia daje tu ważną wskazówkę: niestabilne wodne roztwory poddane dojrzewaniu z lat 90. XIX wieku ustąpiły miejsca stabilizowanym recepturom metanolowym właśnie dlatego, że niekontrolowanych mieszanin nie dało się odtwarzać. Warto przypomnieć sobie tę lekcję przed barwieniem szkiełka diagnostycznego z butelki o niepewnym wieku.

Dbałość o nazewnictwo dopełnia całości. Potwierdź na etykiecie rodzaj produktu katalogowego (wodny, Loefflera lub polichromatyczny), zawartość barwnika i przeznaczenie, zamiast wnioskować z koloru. Te trzy receptury mają wspólnego przodka pod względem chromoforu. Nie mają jednak wspólnego przeznaczenia.