ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ପାଇଁ ମେଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁର ବିକଳ୍ପ: କାର୍ଯ୍ୟ ଅନୁଯାୟୀ ବାଛନ୍ତୁ

ଏକ ସରଳ ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆଲ୍ ସ୍ମିୟର୍‌ରେ, ଯଦି ଲକ୍ଷ୍ୟ କୋଷର ଆକୃତି ଦେଖିବା, ତେବେ କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍ ଭାଇଓଲେଟ୍ ମେଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁକୁ ପ୍ରତିସ୍ଥାପିତ କରିପାରେ। ଜୀବିତ କୋଷ ପାଇଁ, କୌଣସି ଷ୍ଟେନ୍ ବ୍ୟବହାର ନକରି phase contrast ବ୍ୟବହାର କରିବା ଅଧିକ ଉପଯୁକ୍ତ ବିକଳ୍ପ ହୋଇପାରେ। ଆପଣ କେଉଁ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି, ପସନ୍ଦ ସେଥିପରେ ନିର୍ଭର କରେ।

ଧରନ୍ତୁ ଦୁଇଜଣ ବ୍ୟକ୍ତି ସମାନ ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆଲ୍ କଲ୍ଚର୍ ପରୀକ୍ଷା କରୁଛନ୍ତି। ଜଣେ ଦଣ୍ଡାକାର କୋଷକୁ ଗୋଲାକାର କୋଷରୁ ପୃଥକ କରିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି। ଅନ୍ୟଜଣ ଜାଣିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି ଯେ କୌଣସି ଚିକିତ୍ସା ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆକୁ ମାରିଦେଇଛି କି ନାହିଁ। ଯେଉଁ ଷ୍ଟେନ୍ ପ୍ରଥମ ବ୍ୟକ୍ତିଙ୍କୁ ସ୍ପଷ୍ଟ ଛବି ଦେଇପାରେ, ସେହି ଷ୍ଟେନ୍ ଦ୍ୱିତୀୟ ବ୍ୟକ୍ତିଙ୍କୁ ବ୍ୟବହାରଯୋଗ୍ୟ ଉତ୍ତର ନ ଦେଇପାରେ।

ପ୍ରତିସ୍ଥାପକ ବାଛିବା ପୂର୍ବରୁ ଏହି ବାକ୍ୟଟି ପୂରଣ କରନ୍ତୁ: “ମୋତେ ___ ଭିତରେ ___ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରିବାକୁ ହେବ, ଏବଂ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଜୀବିତ ରହିବା ଆବଶ୍ୟକ / ଆବଶ୍ୟକ ନୁହେଁ।” ଏହି ବାକ୍ୟଟି ଷ୍ଟେନ୍‌କୁ କେଉଁ କାମ କରିବାକୁ ହେବ ତାହା ନିର୍ଦ୍ଧାରଣ କରେ।

ନମୁନା ଏବଂ ପ୍ରଶ୍ନରୁ ଆରମ୍ଭ କରନ୍ତୁ

ପ୍ରଥମେ ନିର୍ଦ୍ଧାରଣ କରନ୍ତୁ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଜୀବିତ ରହିବା ଆବଶ୍ୟକ କି ନାହିଁ, ତାପରେ ଆପଣଙ୍କୁ ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ କରିବାକୁ ଥିବା ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ କରନ୍ତୁ:

• କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଜୀବିତ ରହିବା ଆବଶ୍ୟକ: ଗତି କିମ୍ବା ଆକୃତି ପାଇଁ ଷ୍ଟେନ୍ ନକରା phase contrast କିମ୍ବା DIC ବିଚାର କରନ୍ତୁ; ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟାର୍ DNA ପାଇଁ fluorescence ସହିତ Hoechst 33342 ବିଚାର କରନ୍ତୁ; ଝିଲ୍ଲୀର ଅଖଣ୍ଡତା ପାଇଁ SYTO 9 ସହିତ propidium iodide ପରି ଏକ ପ୍ରମାଣିତ assay ବାଛନ୍ତୁ।
• କୋଷଗୁଡ଼ିକ ଜୀବିତ ରହିବା ଆବଶ୍ୟକ ନୁହେଁ: ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆଲ୍ ମର୍ଫୋଲୋଜି ପାଇଁ କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍-ଭାଇଓଲେଟ୍ ସରଳ ଷ୍ଟେନ୍ କିମ୍ବା ନିଗ୍ରୋସିନ୍ ନେଗେଟିଭ୍ ଷ୍ଟେନ୍ ବିଚାର କରନ୍ତୁ; Gram reaction ପାଇଁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ Gram-stain ପ୍ରଣାଳୀ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ; fixed କୋଷର ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟାର୍ DNA ପାଇଁ DAPI fluorescence ବିଚାର କରନ୍ତୁ।

ପ୍ରତ୍ୟେକ ଶାଖାର ସୀମାବଧତା ତୁଳନା କରିବାକୁ ଏହି ସାରଣୀ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ। ଏଗୁଡ଼ିକ ପ୍ରଣାଳୀର ପସନ୍ଦ, ଚାଲୁଥିବା କୌଣସି ପ୍ରୋଟୋକଲ୍‌ରେ ଗୋଟିଏ ବୋତଲକୁ ଅନ୍ୟ ବୋତଲ ସହିତ ବଦଳାଇବାର ନିର୍ଦ୍ଦେଶ ନୁହେଁ।

ସରଳ ସ୍ମିୟର୍ ପାଇଁ, ପ୍ରଣାଳୀକୁ ସାବଧାନତାର ସହିତ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ କରନ୍ତୁ

କାର୍ଯ୍ୟଟି ଯଦି ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆଲ୍ ମର୍ଫୋଲୋଜିକୁ ଏକ ରଙ୍ଗରେ ଦେଖିବା, ତେବେ କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍ ଭାଇଓଲେଟ୍ ଏକ ବ୍ୟବହାରିକ ବିକଳ୍ପ। FDA ର Bacteriological Analytical Manual ରେ ସରଳ staining ପାଇଁ ଉପଯୁକ୍ତ ଦୁଇଟି କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍-ଭାଇଓଲେଟ୍ formulation ଦିଆଯାଇଛି। ଦଳିଲଭୁକ୍ତ formulation ଏବଂ ତାହାର preparation method ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ; କେବଳ dye ର ନାମ ଗୋଟିଏ କାର୍ଯ୍ୟକ୍ଷମ reagent କୁ ସ୍ପଷ୍ଟ କରେ ନାହିଁ।

କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍ ଭାଇଓଲେଟ୍ Gram staining ରେ ମଧ୍ୟ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ, କିନ୍ତୁ ତାହାର ଅର୍ଥ କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍-ଭାଇଓଲେଟ୍ ସରଳ ଷ୍ଟେନ୍ ଏକ Gram stain ନୁହେଁ। ASM Gram-stain protocol ରେ differential result କ୍ରିଷ୍ଟାଲ୍ ଭାଇଓଲେଟ୍, iodine, decolorization ଏବଂ counterstaining କ୍ରମାନୁସାରେ କାମ କରିବା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ। ସେହି ପଦକ୍ଷେପଗୁଡ଼ିକ ଛାଡ଼ିଦେଲେ ଛବିରୁ କ’ଣ ସ୍ଥାପିତ କରାଯାଇପାରିବ ତାହା ପରିବର୍ତ୍ତିତ ହୁଏ। ଏହି ପାର୍ଥକ୍ୟ ପାଇଁ ସରଳ staining ବନାମ Gram staining ଦେଖନ୍ତୁ।

ନିଗ୍ରୋସିନ୍ ବାହ୍ୟରେଖା ଦେଖାଇବାର ଏକ ଭିନ୍ନ ଉପାୟ ଦେଏ: ଏହା ପୃଷ୍ଠଭୂମିକୁ ଗାଢ଼ କରେ, ଯେତେବେଳେ ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆ କୋଷଗୁଡ଼ିକ ତୁଳନାମୂଳକ ଭାବେ ହାଲୁକା ରହେ। Merck ର ନିଗ୍ରୋସିନ୍ ନିର୍ଦ୍ଦେଶାବଳୀ ରେ ଏକ ଉପଯୋଗୀ ବିବରଣୀ ଅଛି ଯାହା ସାଧାରଣ ବିକଳ୍ପ ତାଲିକାରେ ଛାଡ଼ିଯାଇପାରେ। ଏହାର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ working formulation ରେ formaldehyde ଅଛି। ତେଣୁ, କୋଷଗୁଡ଼ିକ ନିଜେ ଷ୍ଟେନ୍ ହୋଇନଥିବା ପରି ଦେଖାଯାଉଥିଲେ ମଧ୍ୟ, “negative stain” ଶବ୍ଦ ମାତ୍ରରୁ live-cell compatibility ନିଷ୍କର୍ଷ କରିହେବ ନାହିଁ। ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ formulation ଏବଂ specimen preparation ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ।

ଜୀବିତ ନମୁନା ପାଇଁ, optics ପରିବର୍ତ୍ତନ ବିଚାର କରନ୍ତୁ

ଯଦି ଆପଣ କୋଷଗୁଡ଼ିକୁ ଗତି କରୁଥିବା କିମ୍ବା ବିଭାଜିତ ହେଉଥିବା ଦେଖିବାକୁ ଚାହୁଁଛନ୍ତି, ତେବେ ଆଉ ଗୋଟିଏ dye ଯୋଗ କରିବା ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣକୁ ଜଟିଳ କରିପାରେ। Nikon ତାହାର ସ୍ୱଚ୍ଛ ନମୁନାରେ contrast ମାର୍ଗଦର୍ଶିକାରେ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରିଥିବା ପରି, phase contrast ଏବଂ differential interference contrast, କିମ୍ବା DIC, ନମୁନାର optical properties ର ପାର୍ଥକ୍ୟ ମାଧ୍ୟମରେ ସେଗୁଡ଼ିକୁ ଦୃଶ୍ୟମାନ କରେ। ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପରେ ଆବଶ୍ୟକ ଉପାଦାନ ଥିଲେ, ଏଗୁଡ଼ିକ ଜୀବିତ ଏବଂ ଷ୍ଟେନ୍ ନକରା କୋଷକୁ ଦେଖାଇପାରେ।

ଏହି ବିକଳ୍ପ ଏକ ଷ୍ଟେନ୍ ନକରା preparation କୁ ଅକ୍ଷୁଣ୍ଣ ରଖେ, କିନ୍ତୁ ଉପଲବ୍ଧ ସୂଚନାକୁ ପରିବର୍ତ୍ତନ କରେ। କେଉଁ molecule contrast ସୃଷ୍ଟି କଲା ତାହା ନଜାଣି ମଧ୍ୟ ଆପଣ ଗୋଟିଏ ସୀମା କିମ୍ବା ଗତିକୁ ଅନୁସରଣ କରିପାରିବେ। ଯଦି ପ୍ରଶ୍ନଟି molecular localization ବିଷୟରେ, ତେବେ ତାହାର ବଦଳରେ ଉପଯୁକ୍ତ labeling method ବାଛନ୍ତୁ।

ନ୍ୟୁକ୍ଲିୟାର୍ DNA ପାଇଁ, Invitrogen ର DAPI ଏବଂ Hoechst stains ର ତୁଳନା fixed କୋଷରେ DAPI ର ସାଧାରଣ ବ୍ୟବହାରକୁ ଅଧିକ cell-permeant Hoechst 33342 ଠାରୁ ପୃଥକ କରେ; Hoechst 33342 କୁ live-cell labeling ପାଇଁ ପସନ୍ଦ କରାଯାଏ। ଉଭୟ ପାଇଁ fluorescence equipment ଆବଶ୍ୟକ। କୌଣସିଟି ମଧ୍ୟ ଏକ ରଙ୍ଗିନ brightfield stain ର ସିଧାସଳଖ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନ ନୁହେଁ।

Dye exposure ଏବଂ illumination କୁ experimental conditions ଭାବେ ବିଚାର କରନ୍ତୁ। କୋଷର ବ୍ୟବହାର ଯଦି ଆପଣଙ୍କର ମାପନ, ତେବେ stained ଏବଂ unstained preparations ତୁଳନା କରନ୍ତୁ।

ଲାଲ୍ କୋଷ ଅବଶ୍ୟ ମୃତ କୋଷ ନୁହେଁ

ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆଲ୍ ଝିଲ୍ଲୀର ଅଖଣ୍ଡତା ଆକଳନ କରିବା ପାଇଁ SYTO 9 ଏବଂ propidium iodide କୁ ପ୍ରାୟତଃ ଏକାସାଥିରେ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। BacLight manual ଅଖଣ୍ଡ ଝିଲ୍ଲୀକୁ ସବୁଜ staining ସହିତ ଏବଂ କ୍ଷତିଗ୍ରସ୍ତ ଝିଲ୍ଲୀକୁ ଲାଲ୍ staining ସହିତ ସମ୍ବନ୍ଧିତ କରେ। ସେହି interpretation କୁ ନମୁନା ପାଇଁ validation ଆବଶ୍ୟକ।

Rosenberg ଏବଂ ସହକର୍ମୀମାନଙ୍କ 2019 ଅଧ୍ୟୟନ ଏହି ସମସ୍ୟାକୁ ଦେଖାଏ। phosphate-buffered saline ମଧ୍ୟରେ କାଚ ଉପରେ 24-hour E. coli biofilms ରେ, ପ୍ରାୟ 96% କୋଷ in situ ରେ propidium-iodide-positive ଦେଖାଯାଇଥିଲା। ତଥାପି, ଲେଖକମାନେ ଆକଳନ କରିଥିଲେ ଯେ harvesting ପରେ 82% cultivable ଥିଲା। Confocal images ରେ ଲାଲ୍-ଷ୍ଟେନ୍ ହୋଇଥିବା ପଦାର୍ଥ ତଳେ ସବୁଜ ଭିତର ଥିବା କୋଷ ଦେଖାଯାଇଥିଲା, ଯାହା ଭ୍ରମଜନକ signal ରେ extracellular nucleic acids ର ଭୂମିକା ସୂଚିତ କରିଥିଲା।

ସେହି ଶତକିଆ ମୂଲ୍ୟଗୁଡ଼ିକ ଅଧ୍ୟୟନର preparations ଉପରେ କରାଯାଇଥିବା ଭିନ୍ନ ମାପନକୁ ବର୍ଣ୍ଣନା କରେ, ସାର୍ବଜନୀନ correction factor କୁ ନୁହେଁ। ଉପଯୋଗୀ ଶିକ୍ଷା ହେଉଛି signal କ’ଣ ଉତ୍ପନ୍ନ କଲା ତାହା ଯାଞ୍ଚ କରିବା। Biofilm ରେ nucleic-acid dye କ୍ଷତିଗ୍ରସ୍ତ କୋଷ ଭିତର ସହିତ କୋଷ ବାହାରର ପଦାର୍ଥକୁ ମଧ୍ୟ ଚିହ୍ନଟ କରିପାରେ। Viability ବିଷୟରେ ନିଷ୍କର୍ଷ ପାଇଁ, ଗବେଷକମାନେ cultivation କିମ୍ବା metabolic activity ପରି ପୂରକ ମାପନ ସୁପାରିଶ କରନ୍ତି, ସେଥିସହ ପ୍ରତ୍ୟେକର ନିଜସ୍ୱ ସୀମାବଧତା ଥିବାକୁ ସ୍ୱୀକାର କରନ୍ତି।

ବିକଳ୍ପରେ ପ୍ରକୃତରେ କ’ଣ ଅଛି ତାହା ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ

ଏକ ବିକଳ୍ପ staining method ମଧ୍ୟରେ ମେଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଥାଇପାରେ। Giemsa ଏହାର ଏକ ଉଦାହରଣ: Merck ତାହାର product କୁ azure-eosin-methylene-blue solution ଭାବେ ବର୍ଣ୍ଣନା କରେ, ଯାହା blood ଏବଂ bone-marrow smears ସହିତ ଅନ୍ୟାନ୍ୟ ପ୍ରୟୋଗ ପାଇଁ ଉଦ୍ଦିଷ୍ଟ। ଏହା ଭିନ୍ନ ନମୁନା ପାଇଁ ଭିନ୍ନ ପ୍ରଣାଳୀ ହୋଇପାରେ, କିନ୍ତୁ ମେଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁକୁ ବାଦ ଦେବାର ଆବଶ୍ୟକତା ପୂରଣ କରେ ନାହିଁ।

ଯଦି କୌଣସି compound କୁ ବାଦ ଦେବା ପରୀକ୍ଷଣର ଅଂଶ, ତେବେ ଛବି ତୁଳନା କରିବା ପୂର୍ବରୁ reagent identity ଏବଂ formulation ଯାଞ୍ଚ କରନ୍ତୁ। methyl blue, methylene blue ଏବଂ ସମାନ ନାମ ଥିବା dyes ବିଷୟକ ମାର୍ଗଦର୍ଶିକାରେ ନାମକରଣର ପାର୍ଥକ୍ୟ ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରାଯାଇଛି।

ଫଳାଫଳ ବ୍ୟବହାର କରିବା ପୂର୍ବରୁ ପ୍ରତିସ୍ଥାପନକୁ ସତ୍ୟାପିତ କରନ୍ତୁ

ନୂତନ ପ୍ରଣାଳୀ ପାଇଁ, ପ୍ରତିନିଧିମୂଳକ ନମୁନା ଏବଂ ଉପଯୁକ୍ତ control ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ଛୋଟ ତୁଳନା କରନ୍ତୁ। ସମ୍ଭବ ଥିଲେ microscope settings କୁ ତୁଳନୀୟ ରଖନ୍ତୁ। Reagent formulation, specimen preparation, exposure ଏବଂ imaging conditions ରେକର୍ଡ କରନ୍ତୁ, ଯାହାଦ୍ୱାରା ଅଧିକ ଭଲ ଦେଖାଯାଉଥିବା ଛବିକୁ କେବଳ ପସନ୍ଦ କରିବା ପରିବର୍ତ୍ତେ ତାହାର କାରଣ ତଦନ୍ତ କରାଯାଇପାରିବ।

ସଫଳତାକୁ ମୂଳ ପ୍ରଶ୍ନ ସହିତ ତୁଳନା କରି ବିଚାର କରନ୍ତୁ। Morphology ପାଇଁ, କୋଷ ସୀମା ଏବଂ ବିନ୍ୟାସ ଏବେ ମଧ୍ୟ ବ୍ୟାଖ୍ୟାଯୋଗ୍ୟ କି ନାହିଁ ଆକଳନ କରନ୍ତୁ। Nuclear labeling ପାଇଁ, signal location ଏବଂ background ଆକଳନ କରନ୍ତୁ। Viability ପାଇଁ, ଆକର୍ଷଣୀୟ color separation ଠାରୁ ଅଧିକ ପ୍ରମାଣ ଆବଶ୍ୟକ କରନ୍ତୁ। ମେଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ staining ଏବଂ laboratory applications ବିଷୟକ ବିସ୍ତୃତ ମାର୍ଗଦର୍ଶିକା ପର୍ଯ୍ୟବେକ୍ଷଣ ଏବଂ preparation କିପରି ପରସ୍ପର ସହିତ ମେଳ ଖାଏ ତାହା ବ୍ୟାଖ୍ୟା କରେ।

ଆପଣଙ୍କୁ ଆବଶ୍ୟକ ମାପନକୁ ଅକ୍ଷୁଣ୍ଣ ରଖୁଥିବା ବିକଳ୍ପ ବାଛନ୍ତୁ। ରଙ୍ଗ ଫଳସ୍ୱରୂପ ମିଳୁଥିବା ଛବିର କେବଳ ଗୋଟିଏ ବୈଶିଷ୍ଟ୍ୟ।