Methyleenblauw en stikstofmonoxide: NOS, cGMP en vasculaire signaaloverdracht

De vraag klinkt eenvoudig: remt methyleenblauw stikstofmonoxide? In het laboratorium valt het antwoord uiteen in vier afzonderlijke vragen, die elk een andere experimentele toets vereisen. Verwarring tussen die vragen is de belangrijkste reden waarom teksten over methyleenblauw en stikstofmonoxide stellig maar vaag overkomen.

Zie het stikstofmonoxidesignaal als een keten met vier schakels. Een gen wordt getranscribeerd om stikstofmonoxidesynthase te maken. Het enzym zet arginine om in stikstofmonoxide. Het gas diffundeert naar zijn doelwit voordat het met iets anders reageert. Oplosbaar guanylaatcyclase detecteert het en maakt cyclisch GMP. Voor elke schakel zijn effecten van methyleenblauw gepubliceerd, maar het bewijs komt uit verschillende preparaten, bij verschillende concentraties en met verschillende isovormen. Een resultaat bij één schakel bewijst geen werking bij een andere.

De gebruikelijke keten, eenvoudig uitgelegd

In een bloedvatwand verloopt de standaardvolgorde als volgt. Een prikkel werkt in op een endotheelcel. Endotheliale stikstofmonoxidesynthase, aangeduid als eNOS of NOS3, maakt een kleine puls stikstofmonoxide. Het gas diffundeert naar de aangrenzende gladde spiercel, bindt aan de heemgroep met gereduceerd ijzer van oplosbaar guanylaatcyclase en versnelt de omzetting van GTP in cyclisch GMP. Cyclisch GMP activeert proteïnekinase G, de calciumhuishouding verandert en de spier ontspant.

Er is een tweede keten die apart moet worden gehouden. Tijdens infectie of blootstelling aan cytokinen transcriberen cellen een ander enzym: induceerbare stikstofmonoxidesynthase, of iNOS, ook NOS2 genoemd. Dit produceert grotere en langer aanhoudende stikstofmonoxidefluxen dan eNOS. Een derde isovorm, neuronale NOS of nNOS, hoort weer bij een andere context. Wanneer een artikel stikstofmonoxidesynthase noemt zonder de isovorm te specificeren, stop dan en controleer welke is gemeten. Het overzicht van hoe methyleenblauw elektronen verplaatst maakt hetzelfde punt voor redoxdoelwitten in het algemeen: de overdracht doet op zichzelf niets, en de partner aan elk uiteinde bepaalt de uitkomst.

Gemeten cyclisch GMP is bovendien een geïntegreerde uitleeswaarde, geen directe enzymbepaling. Het niveau weerspiegelt de synthese door cyclase minus de afbraak door fosfodiësterasen, vooral PDE5 in vasculair glad spierweefsel. Een daling van cyclisch GMP betekent daarom dat minder signaal de detector bereikte. Op zichzelf geeft dat niet aan welke schakel faalde.

Schakel 1: er wordt minder iNOS-enzym gemaakt

In muizenmacrofagen die werden gestimuleerd met bacterieel lipopolysacharide, interferon-gamma of beide, voorkwam methyleenblauw de verwachte stijging van iNOS-eiwit en onderdrukte het iNOS-messenger-RNA sterk in de transcriptie-experimenten met macrofagen. Het informatieve deel is wat niet veranderde. De afbraak van de remmer I kappa B alfa, de fosforylering van NF kappa B en STAT1 en de verplaatsing van die factoren naar de celkern bleven grotendeels intact. Wat afnam, was hun binding aan DNA, bevestigd door chromatine-immunoprecipitatie die een verminderde bezetting van de iNOS-promotor liet zien.

Dat is een genregulerend effect dat voorafgaat aan de hoeveelheid aanwezig enzym, geen acute blokkade van een bestaand enzym. Het hoort bij ontstekingsgerelateerde signaaloverdracht, waarbij transcriptiefactoren aan een promotor moeten binden voordat eiwit verschijnt. Het zegt niets rechtstreeks over constitutieve eNOS in een bloedvat in rust en moet ook zo worden beschreven.

Schakel 2: het bestaande NOS-enzym werkt langzamer

Een onderzoek bij ratten testte een ander niveau. Mannelijke ratten bij bewustzijn kregen intraveneus lipopolysacharide toegediend en ontvingen drie uur later intraveneus óf een fysiologische zoutoplossing óf methyleenblauw met 3 mg per kg. In het onderzoek naar hypothalamische NOS-activiteit werd de stikstofmonoxidesynthase-activiteit in de mediale basale hypothalamus gemeten via de omzetting van gelabeld arginine in citrulline. Stress met alleen een zoutoplossing induceerde enige calciumonafhankelijke activiteit, en lipopolysacharide verhoogde die tot ongeveer tien keer het controleniveau. Methyleenblauw schakelde beide geïnduceerde componenten uit. De calciumafhankelijke constitutieve activiteit veranderde in dat weefsel niet bij die dosis en op dat tijdstip.

Lees dat resultaat precies zoals het is beschreven: onderdrukking van de gemeten activiteit van het iNOS-type onder die omstandigheden. Het is geen meting van genexpressie en geen bewijs voor blijvende selectiviteit voor iNOS boven eNOS of nNOS. Onderzoek met gezuiverde enzymen onderstreept die voorzichtigheid. In directe bepalingen van gezuiverde stikstofmonoxidesynthase blokkeerde methyleenblauw de citrullinevorming volledig bij 30 micromolar, met een concentratie voor halfmaximale remming rond 5.3 micromolar zonder superoxidedismutase en 9.2 micromolar met dit enzym, zoals gerapporteerd in de vergelijking van gezuiverde NOS en guanylaatcyclase. Een afzonderlijk onderzoek met gezuiverde nNOS wees op oxidatie van enzymgebonden heem. De praktische les is dat directe NOS-remming daadwerkelijk voorkomt in geïsoleerde systemen, maar dat het resultaat in de hypothalamus niet kan worden opgerekt tot de algemene bewering dat methyleenblauw overal alle constitutieve NOS ontziet.

Schakel 3: stikstofmonoxide gaat verloren voordat het aankomt

Het duidelijkste bewijs dat iets anders dan enzymblokkade een daling van cyclisch GMP kan verklaren, komt uit gekweekte gladde spiercellen van de longslagader van konijnen. De proefopzet omzeilde endogene NOS volledig door rechtstreeks stikstofmonoxidedonoren toe te voegen. Vervolgens werd in het onderzoek naar superoxide in vasculaire gladde spiercellen nagegaan of methyleenblauw de cyclisch-GMP-respons nog steeds onderdrukte.

Drie donoren werden getest van 1 tot 100 micromolar: S-nitroso-L-cysteïne, natriumnitroprusside en een stabiel gedeamineerd analoog genaamd MPANO. Alle drie verhoogden cyclisch GMP tot ongeveer 1.5 tot 12 keer het uitgangsniveau. Methyleenblauw bij 10 micromolar remde de eerste twee met 51 tot 100 procent en liet de MPANO-respons onveranderd. Als methyleenblauw simpelweg de katalytische plaats van cyclase zou blokkeren, zou die donorselectiviteit moeilijk te verklaren zijn, omdat alle drie op hetzelfde enzym verderop in de keten uitkomen.

Drie controles koppelden het mechanisme vervolgens aan superoxide. Ten eerste leverde de productie van extracellulair superoxide met xanthine plus xanthineoxidase hetzelfde patroon op: CYSNO en nitroprusside werden geblokkeerd, MPANO bleef gespaard. Ten tweede veroorzaakte methyleenblauw dosis- en tijdsafhankelijke superoxideproductie door de gladde spiercellen, gemeten via reductie van cytochroom c. Ten derde voorkwam superoxidedismutase de remming volledig, terwijl catalase dat niet deed. Dit wijst op superoxide en niet op waterstofperoxide als de direct verantwoordelijke reactieve soort in dat preparaat.

De cocultuurversie van het experiment verdient vermelding, omdat die aangeeft waar het effect optreedt. Endotheelcellen op dekglaasjes werden kort samen met gladde spiercellen gekweekt, waardoor de basaal afgegeven endotheelfactor het cyclisch GMP in de gladde spiercellen tot drie tot acht keer het uitgangsniveau verhoogde. Voorbehandeling van een van beide compartimenten met methyleenblauw verminderde dat signaal, en superoxidedismutase herstelde gedeeltelijk het signaalverlies na voorbehandeling van de endotheelcellen. Met andere woorden: methyleenblauw hoeft helemaal niet in de gladde spiercel te werken die als detector fungeert. Het kan het signaal verlagen door de boodschapper onderweg weg te nemen. De gids voor het lezen van onderzoek naar methyleenblauw behandelt dit als een algemene regel: benoem eerst het compartiment waarin de ingreep plaatsvond voordat je een moleculair doelwit benoemt.

Dit NOS-remming noemen zou onjuist zijn. Er was geen synthasestap nodig om de donoren te laten werken, en toch nam het signaal af.

Schakel 4: de detector zelf reageert minder

Directe effecten op oplosbaar guanylaatcyclase bestaan, maar de concentraties zijn van belang. In de hierboven aangehaalde vergelijking van gezuiverde enzymen was voor halfmaximale remming van door stikstofmonoxide gestimuleerde cyclase ongeveer 60 micromolar methyleenblauw nodig, tegenover ongeveer 5 tot 9 micromolar voor halfmaximale NOS-remming. Zelfs 1 millimolar leverde slechts een gedeeltelijke maximale blokkade op. Dat is een verschil van ongeveer zes tot elf keer. Een celexperiment bij een lage micromolaire concentratie dat cyclisch GMP verlaagt, kan daarom niet uitsluitend op grond van de cyclisch-GMP-waarde als selectieve cyclaseremming worden bestempeld.

Een later redoxonderzoek voegde een tweede kanttekening toe: methyleenblauw deactiveerde door stikstofmonoxide geactiveerde cyclase via een mechanisme dat verschilde van eenvoudige oxidatie van het heemijzer door lucht. De detector kan dus worden verstoord, maar de chemie is nog niet opgehelderd. Het concentratieverschil betekent bovendien dat bij blootstelling aan lage micromolaire concentraties eerst de effecten van superoxide en NOS moeten worden uitgesloten. Hier hoort ook controle van fosfodiësterase thuis. Tenzij de afbraak werd gemeten of geblokkeerd, past verminderde ophoping van cyclisch GMP bij minder synthese, snellere afbraak of beide.

Waarom dit niet neerkomt op één bewering over bloeddruk

Elke schakel werd in een ander systeem vastgesteld. Transcriptie in macrofagen is niet hetzelfde als enzymactiviteit in de hypothalamus. Hypothalamische activiteit na lipopolysacharide is niet hetzelfde als endotheliale tonus in rust. Basaal afgegeven endotheelfactor in cocultuur is niet hetzelfde als door een agonist gestimuleerde vaatverwijding. Gekweekte cellen uit de longslagader bij 10 micromolar methyleenblauw zijn geen menselijke bloedsomloop. Door dit samen te vatten als een uitspraak zoals methyleenblauw verhoogt de bloeddruk door stikstofmonoxide te blokkeren, verdwijnen precies de verschillen die de controles moesten behouden.

Drie controles houden het verhaal zuiver. Benoem ten eerste de isovorm: eNOS voor vasculaire tonus in rust, iNOS voor geïnduceerde ontstekingsgerelateerde flux en nNOS voor neuronale contexten en sommige contexten met gezuiverde enzymen. Benoem ten tweede hoe het stikstofmonoxidesignaal wordt aangeleverd: endogene synthese, basale afgifte door endotheel of een specifieke donor zoals CYSNO, nitroprusside of MPANO, omdat de stabiele donor bestand was tegen methyleenblauw en de labiele donoren niet. Benoem ten derde de concentratie en de herstelcontrole: herstel door superoxidedismutase wijst op superoxide, het uitblijven van een effect van catalase pleit tegen waterstofperoxide in dat preparaat, nabootsing door xanthineoxidase laat zien dat dit mechanisme voldoende is, en bepalingen met gezuiverde enzymen scheiden directe effecten op katalyse van verliezen tijdens het transport.

De beknopte synthese is deze. Methyleenblauw kan beter worden beschouwd als een stof die de signaaloverdracht van stikstofmonoxide naar cyclisch GMP op meerdere plaatsen verstoort dan als een selectieve cyclaseblokker. Afhankelijk van het preparaat en de concentratie kan het de binding van transcriptiefactoren voor iNOS verminderen, NOS-enzymen rechtstreeks remmen, de beschikbaarheid van stikstofmonoxide verlagen door superoxidevorming en door stikstofmonoxide geactiveerde cyclase verstoren. De rol van cyclisch-GMP-signaaloverdracht in vasculaire onderzoeken en de vergelijking van stikstofmonoxidedonoren die bij celbepalingen worden gebruikt behandelen elk een van die vertakkingen nader. De methoden om redoxeffecten van enzymeffecten te onderscheiden leggen uit waarom superoxidedismutase plus catalase plus een controle met een stabiele donor zo vaak in deze literatuur voorkomen.

Een lage cyclisch-GMP-waarde na methyleenblauw wijst op een onderbroken keten. Alleen de controles vertellen welke schakel brak.