De mitochondriale effecten van methyleenblauw meten: zuurstof, ATP en membraanpotentiaal

Stel dat een laboratorium methyleenblauw toevoegt aan mitochondriën met een verstoorde respiratie en het zuurstofverbruik ziet stijgen. Het ligt voor de hand om te schrijven dat de kleurstof de mitochondriale functie heeft hersteld. Die zin kan onjuist zijn. Zuurstofflux, ATP-synthese en membraanpotentiaal zijn drie verschillende begrippen. Ze delen hetzelfde organel zoals back-up, synchronisatie en delen dezelfde cloudmap delen: ze hangen samen, maar volgen verschillende regels. Verwar het ene met het andere en de interpretatie gaat mis, zelfs als elke meting technisch correct is.

Methyleenblauw maakt die verwarring waarschijnlijk omdat het deelneemt aan het systeem dat ermee wordt gemeten. Het is een redoxcycler die stroomopwaarts elektronen opneemt en stroomafwaarts afgeeft, een lipofiel kation dat zich ophoopt in mitochondriën met een opgebouwde membraanpotentiaal, en een sterk blauwe verbinding die licht absorbeert en uitzendt in dezelfde golflengtebanden als veelgebruikte probes. Eén meetwaarde kan dat niet allemaal ondervangen. De betrouwbare aanpak, zoals toegepast in de mitochondriale studies uit Boedapest, is om zuurstofflux, ATP-synthesesnelheid, membraanpotentiaal en waterstofperoxideafgifte te meten, met kleurstofspecifieke controles bij elke stap.

Respirometrie meet zuurstofflux, geen energieopbrengst

Hogeresolutierespirometrie, met een Oroboros Oxygraph of een Seahorse-analyser voor extracellulaire flux, rapporteert één ding: hoe snel zuurstof wordt gereduceerd. Ze rapporteert niet hoeveel protonen per elektron zijn gepompt, hoeveel van de gradiënt behouden bleef of of ATP-synthase die heeft gebruikt.

De terminologie doet ertoe. Bij geïsoleerde mitochondriën levert substraat zonder ADP lekrespiratie op, substraat met een verzadigende hoeveelheid ADP de capaciteit voor oxidatieve fosforylering, en titratie met een ontkoppelaar de maximale elektronenoverdrachtscapaciteit. In intacte cellen zijn de Seahorse-equivalenten basale respiratie, oligomycinegevoelige ATP-gekoppelde respiratie, protonlek, FCCP-gedefinieerde maximale respiratie en rotenon- plus antimycineresistent niet-mitochondriaal zuurstofverbruik. Door Seahorse-uitkomsten State 3 en State 4 te noemen, suggereer je een precisie die het preparaat niet ondersteunt, zoals het Agilent Mito Stress Test-kader duidelijk maakt.

Methyleenblauw doorbreekt het intuïtieve verband tussen meer zuurstof en meer energie. In geïsoleerde mitochondriën uit caviaherenen verhoogde 100 nM tot 1 uM kleurstof het zuurstofverbruik in rust met glutamaat plus malaat, succinaat en alfa-glycerofosfaat als substraten, met ongeveer 64 procent stijging bij alfa-glycerofosfaat. Toch bleef de ADP-gestimuleerde respiratie in gezonde mitochondriën vrijwel onveranderd, volgens de studie met geïsoleerde hersenmitochondriën. Omdat de lekrespiratie steeg terwijl de ADP-gestimuleerde flux gelijk bleef, daalt de berekende respiratoire controleratio. Die daling betekent niet dat de kleurstof de mitochondriën heeft beschadigd. Ze betekent dat de kleurstof boven op de normale respiratie een zuurstofverbruikende redoxcyclus toevoegde. Een assay voor zuurstofverbruik met methyleenblauw die alleen de stijging rapporteert, heeft echte chemie gemeten maar niets gezegd over energiebehoud.

De herstelexperimenten laten dezelfde kloof op grotere schaal zien. Bij blokkering van Complex I herstelde de zuurstofflux tot ongeveer het drievoudige, terwijl de ATP-synthese slechts tot ongeveer het 1.5-voudige herstelde. Meer zuurstof bereikte de elektrode. Een kleiner deel daarvan droeg bij aan ATP-productie. Elke claim over verbeterde oxidatieve fosforylering vereist ook de ATP-kant van de balans, bij voorkeur uitgedrukt als een ATP-per-zuurstofratio met vermelding van de gebruikte noemerconventie.

ATP-assays meten de synthesesnelheid, die niet door de ATP-inhoud kan worden vervangen

Een ATP-assay beantwoordt een andere vraag: hoeveel ATP wordt er per tijdseenheid geproduceerd? Een kinetische meting, via vuurvliegluciferase-luminescentie die gedurende minuten wordt gevolgd of via een gekoppelde assay met hexokinase plus glucose-6-fosfaatdehydrogenase die bij 340 nm wordt afgelezen, levert een snelheid op. Eén eindpuntmeting van totaal ATP levert een inhoud op, die synthese minus verbruik weerspiegelt en op zichzelf weinig zegt over oxidatieve fosforylering.

De groep uit Boedapest gebruikte de gekoppelde enzymatische methode met onderdrukking van adenylaatkinase en ontdekte dat methyleenblauw bij 1 tot 2 uM de ATP-productie in met rotenon en met antimycine behandelde mitochondriën bescheiden maar significant verhoogde. Dat is daadwerkelijk herstel, maar slechts gedeeltelijk. De studie naar TEGDMA-toxiciteit kwam in een ander model tot een vergelijkbaar resultaat: 5 mM van het tandheelkundige monomeer TEGDMA liet de aan Complex I gekoppelde respiratie dalen van ongeveer 286 naar 28 fluxeenheden, en 2 uM kleurstof herstelde die tot ongeveer 86.

Twee controles zijn onmisbaar bij een gekleurde redoxverbinding. Gebruik ten eerste oligomycine om vast te stellen welk deel van de gemeten ATP-synthese afhankelijk is van ATP-synthase. Voer ten tweede een celvrije terugvindingstest met toegevoegd ATP uit, met een bekende hoeveelheid ATP, het volledige reagens en precies de gebruikte kleurstofconcentraties, minimaal 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM en 2 uM. De kleurstof kan uitgezonden licht absorberen, het reporterenzym remmen of de redoxchemie van het reagens veranderen. Algemene richtlijnen voor luciferase-assays bevelen biochemische tegenassays aan voor precies dit type interferentie. Ga er niet van uit dat 1 uM vrij is van artefacten omdat quenching doorgaans sterker is bij hogere concentraties.

Membraanpotentiaalprobes meten de kleurstofverdeling, geen flux

Safranine O, TMRM en TMRE, rhodamine 123 en JC-1 zijn allemaal membraanpermeabele kationen. Ze hopen zich op in de negatief geladen matrix volgens het elektrochemische evenwicht. De totale fluorescentie rapporteert de potentiaal dus indirect via de locatie van de probe. Geen van deze probes meet ATP of elektronenflux.

Elke probe heeft een preparaat waarvoor hij het meest geschikt is. Safranine O is geschikt voor geïsoleerde mitochondriën en gepermeabiliseerde cellen, doorgaans rond 2 uM met excitatie rond 495 nm en emissie rond 585 nm, in een quenchingregime waarbij opname de totale fluorescentie verandert. TMRM en TMRE zijn geschikt voor intacte cellen bij lage nanomolaire belading in niet-quenchende modus, waarbij depolarisatie de kleurstof vrijmaakt en de mitochondriale fluorescentie afneemt; bij hoge belading kan de richting van het signaal omkeren door zelfquenching. JC-1 geeft een handige groen-roodratio, maar is afhankelijk van belading en mitochondriale massa, waardoor het minder geschikt is voor kwantitatief werk dan zorgvuldig gecontroleerde TMRM. Deze afwegingen worden samengevat in een veelgebruikt overzicht van mitochondriale membraanpotentiaalprobes.

Methyleenblauw veroorzaakt optische interferentie bij precies de gebruikte werkconcentraties. De absorptiebanden rond 600 tot 665 nm overlappen met de rode emissie van probes, waardoor binnenfiltereffecten, quenching en absorptie van excitatielicht allemaal aannemelijk zijn. De kleurstof is bovendien een tweede lipofiel kation waarvan de eigen verdeling verandert met de potentiaal die wordt gemeten. De bescherming bestaat uit redundantie en blanco's: alleen de probe, alleen de kleurstof, de probe plus elke kleurstofconcentratie, volledige depolarisatie met FCCP als nulreferentie en bij voorkeur een tweede, optisch verschillende probe. De studie naar het omzeilen van Complex III gaf daarin het voorbeeld door het herstel van de membraanpotentiaal na remming met antimycine en myxothiazol te herhalen met zowel safranine O als TMRM, en hetzelfde kwalitatieve herstel te vinden. Eén optische reporter is een aanwijzing. Twee onafhankelijke reporters zijn bewijs.

Drie preparaten, drie verschillende vragen

Geïsoleerde mitochondriën, gepermeabiliseerde cellen en intacte cellen zijn geen onderling uitwisselbare gevoeligheidsinstellingen van één assay. Het zijn verschillende concepten met verschillende werkingsprincipes.

Geïsoleerde mitochondriën behouden de elektronentransportketen, het binnenmembraan en de machinerie in de matrix, terwijl het plasmamembraan, het cytosol en de netwerkarchitectuur worden verwijderd. Dat verwijderen is juist het doel: substraten, ADP, remmers en kleurstofconcentraties worden nauwkeurig vastgelegd, zodat een route kan worden toegewezen. Daar staat het verlies van de oorspronkelijke substraataanvoer, signalering en energievraag tegenover.

Gepermeabiliseerde cellen houden mitochondriën binnen een groot deel van hun cellulaire architectuur, terwijl exogene substraten en ADP door het geopende plasmamembraan kunnen passeren. Ze zijn het juiste hulpmiddel om een defect in een substraatafhankelijke route binnen een cellulaire context te lokaliseren. Overmatige permeabilisatie beschadigt het buitenmembraan en cytosolische regulatie spoelt weg.

Intacte cellen behouden alles: de plasmamembraanbarrière, cytosolische reductoren, endogeen substraattransport, het mitochondriale netwerk en de ATP-vraag. Ze staan het dichtst bij de fysiologie en het verst van het mechanisme, omdat opname, reductie en sequestratie van de kleurstof allemaal de effectieve mitochondriale blootstelling bepalen.

De TEGDMA-studie gebruikte bewust alle drie de niveaus: geïsoleerde hersenmitochondriën voor herstel van oxidatie en potentiaal door de kleurstof, gepermeabiliseerde stamcellen uit tandpulpa vooral om de verstoring te lokaliseren bij de aan Complex I gekoppelde substraatoxidatie, en intacte stamcellen voor het fysiologische netto-effect van 2 uM kleurstof op onderdrukt zuurstofverbruik. Voor lezers die mitochondriale meetuitkomsten tussen preparaten vergelijken, geeft het bijbehorende uitlegstuk over hoe methyleenblauw elektronen door de ademhalingsketen verplaatst de achtergrond van de route. De gids voor het lezen van respiratiestudies met methyleenblauw behandelt de logica achter concentraties en remmers.

Controles die een redoxactieve kleurstof vereist

Een redoxcycler vereist een langere lijst controles dan een gewone remmer, omdat chemie van de kleurstof alleen biologische processen kan nabootsen.

Gebruik voor respirometrie een kamer met alleen buffer om drift te meten, een kamer met buffer plus kleurstof zonder biologisch materiaal, kleurstof plus elke extracellulaire reductor die in de assay aanwezig is, en aan het einde rotenon plus antimycine om niet-mitochondriaal zuurstofverbruik in intacte cellen te bepalen. Houd er rekening mee dat gereduceerde kleurstof opnieuw oxideert door elektronen aan zuurstof over te dragen, waarbij waterstofperoxide ontstaat. Een blanco met alleen kleurstof zonder elektronendonor onderschat daardoor het celvrije zuurstofverbruik dat optreedt zodra NADH of NADPH beschikbaar is.

Geef voor waterstofperoxide de voorkeur aan gekalibreerd Amplex UltraRed plus mierikswortelperoxidase boven niet-selectieve DCFDA-kleurstoffen, verifieer met catalase en test de afhankelijkheid van belichting, omdat de kleurstof een fotosensibilisator is. De studie met hersenmitochondriën vond dat de peroxidebelasting al bij slechts 100 nM kleurstof meer dan verviervoudigde, terwijl de verwijdering vertraagde. Peroxide werd rechtstreeks door gereduceerde kleurstof gevormd, zonder superoxide als tussenproduct. Details over de keuze van probes en lichtcontroles staan in het bijbehorende artikel over het meten van reactieve zuurstofsoorten in kleurstofexperimenten. De bredere vraag wanneer peroxide als signaal werkt en wanneer als belasting, wordt behandeld bij cellulaire redoxbalans en antioxidantclaims.

Test voor claims over de route beide remmerbindingsplaatsen van Complex III: antimycine A op de Qi-plaats en myxothiazol op de Qo-plaats, plus een eindpunt voor Complex IV met cyanide. Een eerdere studie met muizenhersenen rapporteerde herstel door de kleurstof van door rotenon geblokkeerde respiratie, maar niet van door antimycine geblokkeerde respiratie. De latere studie met drie soorten vond gedeeltelijk herstel met beide remmers en aanwijzingen voor rechtstreekse reductie van cytochroom c. Beschouw de omleidingsroute als verenigbaar met de nieuwere gegevens, niet als definitief vastgesteld: kleurstofconcentratie, remmerbindingsplaats, substraattoestand en kleurstofverdeling veranderen allemaal de waargenomen route.

Assayselectiematrix

Gebruik deze tabel om de meting bij de vraag te kiezen, niet andersom.

Voor een minimaal overtuigende claim worden dezelfde kleurstofconcentraties, 100 nM, 300 nM, 1 uM en 2 uM, gebruikt bij metingen van zuurstofflux onder lek-, ADP-, oligomycine- en ontkoppelaarcondities, ATP-synthesesnelheid, membraanpotentiaal met bij voorkeur twee probes, en gekalibreerde peroxideafgifte met catalase en celvrije controles. Rapporteer de samenhangende reeks: zuurstofflux plus ATP-snelheid plus ATP per zuurstof plus potentiaal plus peroxide. Elk van die getallen afzonderlijk is een meting die nog op zoek is naar betekenis.