Methyleenblauw en lichtblootstelling: golflengte, irradiantie en behandelgeometrie

Twee publicaties beschrijven blootstelling van methyleenblauw aan 10 J per vierkante cm licht. De ene doodt bacteriën. De andere heeft geen meetbaar effect. Een lezer die alleen de dosis vergelijkt, concludeert dat het onderzoeksveld inconsistent is. Het onderzoeksveld is consistent. De dosis beschreef nooit de volledige blootstelling.

Een lichtblootstelling is een klein systeem van parameters die samen werken: golflengte, irradiantie, duur, de resulterende fluëntie, zuurstofbeschikbaarheid, kleurstofconcentratie en aggregatietoestand, de tijd tussen kleurstoftoediening en belichting, en de optische weg die het licht daadwerkelijk door het monster aflegt. Verander één parameter en de fotochemie verandert. Dit artikel behandelt elke parameter en maakt vervolgens onderscheid tussen nabij-infrarode fotobiomodulatie en directe fotoactivatie van de kleurstof, omdat deze twee regimes het vaakst met elkaar worden verward.

De golflengte bepaalt of de kleurstof een rol speelt

Methyleenblauw in water absorbeert als monomeer sterk rood licht, met een piek rond 664 tot 665 nm en een schouder bij een kortere golflengte rond 610 nm, die groter wordt naarmate de kleurstof aggregeert tot dimeren en grotere stapelingen. De molaire extinctie nabij de piek ligt in de orde van 65,000 tot 85,000 M-1 cm-1, waardoor micromolaire oplossingen al intens blauw zijn. Het vroege fotochemische overzicht van methyleenblauw met DNA en biologische substraten beschrijft dit absorptiegedrag en de daaropvolgende chemie van de aangeslagen toestand: absorptie brengt moleculen in een kortlevende singlettoestand, waarna ze overgaan naar een langer levende triplettoestand met gerapporteerde opbrengsten rond 0.5, die in een beluchte oplossing binnen ongeveer 2 microseconden door zuurstof wordt gedeactiveerd.

Bij die deactivatiestap lopen de twee fotochemische routes uiteen. Bij Type II-chemie draagt de kleurstof in de triplettoestand energie over aan zuurstof in de grondtoestand en produceert zo singletzuurstof, met vaak aangehaalde opbrengsten rond 0.52. Bij Type I-chemie draagt de triplettoestand in plaats daarvan een elektron of waterstof over aan een substraat, waardoor radicalen ontstaan, waaronder superoxide- en hydroxylsoorten. Beide kunnen tegelijkertijd plaatsvinden, en het conventionele fotodynamische effect blijft sterk zuurstofafhankelijk, ook wanneer Type I bijdraagt.

Daaruit volgt een eenvoudige regel voor de keuze van de golflengte bij methyleenblauw. Rood licht van ongeveer 630 tot 680 nm overlapt met de absorptieband van de kleurstof, waarbij 660 tot 665 nm dicht bij het monomeermaximum ligt. Het kan dus fotosensibiliserende chemie aandrijven waar een noemenswaardige hoeveelheid kleurstof aanwezig is. Nabij-infrarood bij 810 nm ligt ver buiten de absorptieband van de grondtoestand en is daarom een ongeschikte golflengte voor directe excitatie van de kleurstof. Concentratie maakt het beeld op één wezenlijke manier complexer: naarmate de concentratie stijgt, bevindt meer kleurstof zich in dimere en geaggregeerde vormen die richting 610 nm absorberen en per molecuul minder efficiënt fotosensibiliseren. Een verdubbeling van de kleurstof verdubbelt het effect dus niet. Het bijbehorende overzicht van methyleenblauw met roodlichttherapie behandelt deze absorptieregel als voorwaarde voor elke fotosensibiliserende reactie.

Irradiantie, duur en fluëntie zijn drie parameters, niet één

Fluëntie, in J per vierkante cm, is irradiantie vermenigvuldigd met tijd. Alleen de fluëntie rapporteren verhult de snelheid waarmee de energie werd toegevoerd, en die snelheid doet ertoe.

Een korte blootstelling met hoge irradiantie en een lange blootstelling met lage irradiantie kunnen dezelfde fluëntie opleveren, maar met verschillende chemie. Hoge irradiantie verbruikt opgeloste zuurstof sneller dan diffusie die aanvult, waardoor de zuurstofafhankelijke Type II-route tijdens de blootstelling wordt afgeremd. Ze voert ook warmte toe, en weefsel reageert op opwarming met veranderingen in de doorbloeding die zowel de zuurstofvoorziening als de kleurstofverdeling beïnvloeden. Lage irradiantie gedurende een lange blootstelling houdt de zuurstoftoevoer op peil, maar geeft herstel- en heroxygenatieprocessen tijd om tijdens de blootstelling zelf te werken. Leerboeken over fotochemie noemen de aanname dat alleen de totale dosis telt reciprociteit. Die aanname gaat niet op zodra zuurstof, opwarming of biologie een rol speelt, wat in weefsel vrijwel altijd het geval is.

Antimicrobiële fotodynamische blootstellingen met methyleenblauw bij mensen gebruiken doorgaans 6 tot 18 J per vierkante cm, wat overlapt met waarden voor fotobiomodulatie. De fluëntie alleen kan het regime dus niet bepalen. Een blootstelling van 10 J per vierkante cm bij 660 nm op weefsel met kleurstof is fotochemie die door een fotosensibilisator wordt aangedreven. Dezelfde fluëntie bij 810 nm op weefsel met sporen kleurstof is iets heel anders. Het getal komt overeen. Het concept verschilt.

De optische weg en monstergeometrie bepalen wat het licht tegenkomt

Het gedrag volgens de wet van Beer-Lambert betekent dat de voorkant van een monster veel meer licht ontvangt dan de achterkant. In een cuvet met tientallen micromolair kleurstof kan de eerste millimeter het grootste deel van het invallende rode licht absorberen, waardoor diepere lagen in feite onbelicht blijven. Breng dezelfde oplossing in een klein volume in een ondiepe well en de blootstelling wordt vrijwel uniform. Dezelfde kleurstof, dezelfde lamp, dezelfde fluëntie aan het oppervlak, een ander resultaat.

Weefsel voegt naast absorptie ook verstrooiing toe. Rood licht rond 660 nm dringt in de orde van millimeters door, waarbij de precieze diepte wordt bepaald door het bloedgehalte, de pigmentatie en het weefseltype. Wells voegen hun eigen artefacten toe: lenswerking van de meniscus, reflectie door de wanden, beschaduwing van wells aan de rand en opwarming van kleine volumes onder de lichtbron. Twee laboratoria die identieke lampinstellingen rapporteren maar verschillende plaattypen, volumes of afstanden tot de lichtbron gebruiken, hebben verschillende experimenten uitgevoerd.

Afstand verdient nadruk, omdat dit de meest voorkomende onopgemerkte variabele is. De irradiantie neemt snel af met de afstand tot een niet-gecollimeerde bron. Een lamp die van 2 cm naar 5 cm boven de plaat wordt verplaatst, kan de irradiantie dus met een factor van enkele malen verlagen, terwijl de methodesectie nog steeds hetzelfde vermeldt. Zonder gemeten irradiantie aan het monsteroppervlak zijn gepubliceerde fluënties die op basis van vermogensspecificaties van de fabrikant zijn berekend schattingen, geen metingen.

Geannoteerde parametergids: wat maakt een blootstelling reproduceerbaar

Het oorspronkelijke hulpmiddel voor deze pagina is een checklist. Een lichtblootstelling in een onderzoek waarbij deze gegevens ontbreken, kan niet met een andere worden vergeleken, hoe vergelijkbaar de vermelde dosis ook lijkt.

1. Golflengte en bandbreedte. Piek en volledige breedte, niet een kleurnaam. Rode leds bestrijken 630 tot 680 nm, met sterk uiteenlopende kleurstofabsorptie.
2. Irradiantie aan het monsteroppervlak, gemeten, in mW per vierkante cm. Het door de fabrikant opgegeven vermogen in watt is geen irradiantie.
3. Duur en pulsering. Continue versus gepulste belichting, inclusief pulsfrequentie en inschakelduur waar van toepassing.
4. Fluëntie berekend uit de twee bovenstaande gemeten waarden, in J per vierkante cm.
5. Kleurstofconcentratie, formulering en aggregatietoestand. Het monomeer rond 664 nm fotosensibiliseert anders dan aggregaten rond 610 nm.
6. Interval tussen kleurstoftoediening en belichting. Minuten tot uren tussen toediening van de kleurstof en bestraling, wat bepaalt waar de kleurstof zich bevindt wanneer het licht aankomt.
7. Zuurstofvoorziening. Een beluchte oplossing versus hypoxisch weefsel verandert rechtstreeks de balans tussen Type I en Type II.
8. Geometrie. Monsterdiepte, volume, type houder, afstand en hoek van de lichtbron, en de diepte van het doelweefsel.

Een nuttige gewoonte bij het lezen van publicaties: controleer eerst het interval tussen kleurstoftoediening en belichting. Dat laat het doel zien. Fotodynamische onderzoeksopzetten bestralen bewust weefsel met kleurstof. Gecombineerde onderzoeksopzetten kunnen de twee juist bewust scheiden, zoals hieronder.

Nabij-infrarode fotobiomodulatie is geen fotoactivatie van de kleurstof

Fotobiomodulatie, meestal afgekort als PBM, gebruikt rood of nabij-infrarood licht om endogene signaalprocessen te moduleren zonder een fotosensibilisator toe te voegen. Fotodynamische therapie, meestal afgekort als PDT, gebruikt drie onderdelen samen: licht dat de sensibilisator absorbeert, de sensibilisator zelf en zuurstof om een plotselinge toename van reactieve soorten te veroorzaken die het doelwit beschadigt. Een overzicht van mitochondriën als doelwit voor neuroprotectie combineert methyleenblauw met PBM omdat ze vanuit verschillende invalshoeken op de celademhaling inwerken: de kleurstof werkt als katalytische redoxcycler die de elektronenstroom ondersteunt, terwijl wordt verondersteld dat PBM de dissociatie van remmend stikstofmonoxide van cytochroom-c-oxidase bij Complex IV bevordert. Dat enzymmechanisme moet als hypothese aangeduid blijven.

De twee meest aangehaalde combinatiestudies bij muizen gebruiken beide licht van 810 nm, en juist daarom tonen ze geen fotoactivatie van de kleurstof aan. In een onderzoek naar voorbehandeling vóór slaapdeprivatie kregen muizen vóór de deprivatie dagelijks methyleenblauw in een dosis van 0.5 mg per kg, om de dag een gepulste laser van 810 nm, of beide. De gecombineerde voorbehandeling beschermde geheugengerelateerd gedrag en synaptische eiwitten in de hippocampus, terwijl afzonderlijke behandelingen grotendeels geen effect hadden. In een onderzoek naar chronische stress met gelijktijdige behandeling kregen muizen PBM van 810 nm bij 8 J per vierkante cm naast dagelijks kleurstof in een dosis van 0.5 mg per kg. De laser werd eerst toegepast en de kleurstof werd twee uur later geïnjecteerd, specifiek om bestraling van weefsel met kleurstof te vermijden. Alle drie de behandelarmen maakten leerstoornissen ongedaan, met vooral een additief voordeel voor serumcortisol en reactieve zuurstofsoorten in de hersenen. Deze resultaten toetsen twee mitochondriale interventies die samen worden gebruikt, een onderscheid dat de verzameling fotodynamische onderzoeken zichtbaar houdt door de golflengte per indicatie vast te leggen.

Het bewijs voor de huid bevindt zich aan de andere kant. Gegevens bij mensen over methyleenblauw plus licht voor de huid concentreren zich rond 630 tot 680 nm, met topisch of intralesionaal toegediende kleurstof en met vernietiging of remodellering als doel. Dat is per definitie PDT. Die klaring aanhalen als bewijs dat kleurstof PBM versterkt, of een herstelresultaat bij muizen met 810 nm aanhalen als bewijs dat een paneel van 660 nm plus kleurstof een protocol voor cognitie vormt, verwart de regimes. Het naslagwerk over dosering en farmacologie en de gids over veiligheid en interacties werken de onderdelen van dit verhaal over concentratie en contra-indicaties verder uit.

Benoem het concept voordat je getallen vergelijkt. De golflengte bepaalt of de kleurstof absorbeert. Irradiantie en duur bepalen wat de chemie met die absorptie doet. Geometrie bepaalt welk deel van het monster daar überhaupt aan wordt blootgesteld. Twee blootstellingen die op één parameter overeenkomen en op de overige verschillen, zijn verschillende experimenten. Ze als onderling uitwisselbaar behandelen is de fout die deze gids wil voorkomen. Hieruit volgt geen enkel protocol voor thuisgebruik; licht met een passende golflengte plus systemisch toegediende kleurstof verandert een anders modulerende blootstelling in fotochemie die door een fotosensibilisator wordt aangedreven, en dat hoort in klinische handen.