Methyleenblauw als indicator voor anaerobiose en zuurstof: wat de kleurverandering aantoont

Een laboratoriummedewerker sluit een anaerobe kweekpot af, controleert de methyleenblauw-indicatorstrip door het deksel en ziet wat ze wil zien. De strip is van blauw naar wit veranderd. Ze registreert de kweekronde als anaeroob en gaat verder. Twee dagen later groeit er op één plaat niets, terwijl een afgesloten buis met bouillon in dezelfde pot tekenen van zuurstofblootstelling vertoont. De strip vertelde de waarheid. Zij stelde de verkeerde vraag.

De verwarring is een begripsverwarring. Een methyleenblauw-indicator voor anaerobiose berust op een redoxprincipe, niet op een steriliteitsprincipe en ook niet op validatie van het hele systeem. Zodra dat onderscheid duidelijk is, wordt de strip een nauwkeurig en betrouwbaar instrument met een beperkte taak.

Het principe: een omkeerbaar redoxpaar

Opgelost methyleenblauw komt in twee toestanden voor. De geoxideerde vorm is het bekende blauwe kation. De gereduceerde vorm, leucomethyleenblauw genoemd, is kleurloos. Bij een vrijwel neutrale pH bestaat de vereenvoudigde halfreactie uit één blauw kation plus één proton plus twee elektronen, die samen één kleurloos leucomolecuul opleveren. De formele potentiaal ligt rond plus 11 millivolt ten opzichte van de standaardwaterstofelektrode bij pH 7. Daarmee valt deze binnen een bereik dat veel reducerende systemen kunnen bereiken en dat zuurstof kan omkeren.

Reductie vereist een lage lokale redoxpotentiaal. Alleen zuurstof verwijderen is niet altijd voldoende. Vroeg onderzoek naar anaerobiose liet zien dat methyleenblauw in gewoon zuurstofvrij water zijn kleur behield tenzij er een reducerende stof aanwezig was. Mengsels van dextrosebouillon met ongeveer 0.01 procent kleurstof ontkleurden gemakkelijk bij 37 C, terwijl hetzelfde mengsel bij 4 C een dag lang blauw bleef, zoals beschreven in experimenten met vers weefsel en anaerobe kweekomstandigheden. Temperatuur, pH, glucose, ascorbaat, thioglycollaat en microbiële reducerende activiteit bepalen allemaal of de elektronen beschikbaar zijn.

Voor heroxidatie is alleen zuurstof nodig. Wanneer lucht de leucovorm bereikt, wordt deze weer blauw. Moderne, speciaal ontwikkelde indicatoren benutten precies deze cyclus: kleurstof plus reductiemiddel plus een stabiliserende matrix, kleurloos bij weinig zuurstof en weer blauw na blootstelling aan lucht. Dit is aangetoond met een hybride methyleenblauw-zuurstofindicator op basis van kleurstof, reductiemiddel, oppervlakteactieve stof en klei. Dat prototype gebruikte 0.01 millimolaire kleurstof met 2.0 millimolair ascorbaat of glucose bij pH 11, werd kleurloos rond 0.5 volumeprocent zuurstof en maakte in zijn testkamer onderscheid tussen minder dan 0.1 procent en meer dan 0.5 procent zuurstof.

Het werkingsprincipe is dus eenvoudig. Blauw betekent dat de indicatorzone geoxideerd is. Kleurloos betekent dat de indicatorzone reducerende omstandigheden met weinig zuurstof heeft bereikt. De verandering is omkeerbaar, lokaal en chemisch. Op zichzelf zegt ze niets over micro-organismen.

Hoe een methyleenblauw-indicatorstrip in een anaerobe kweekpot werkt

Een methyleenblauw-indicatorstrip voor een anaerobe kweekpot is een kleine reactiezone die in de atmosfeer van de pot wordt geplaatst, zodat deze zichtbaar is zonder de pot te openen. Commerciële uitvoeringen verschillen: papieren strips, tabletten die bij het opzetten worden opgelost of bevochtigd, en nieuwere hybride papiersoorten. Sommige vereisen één druppel gedestilleerd water om de reactiezone te activeren. Andere zijn droge indicatoren die droog moeten blijven. De gebruiksaanwijzing van het specifieke product is leidend, omdat bevochtiging, plaatsing en afleestijd deel uitmaken van de chemie.

In de praktijk is de beoogde aflezing binair. Blauw betekent dat er bij de strip nog zuurstof aanwezig is of dat de omstandigheden onvoldoende reducerend zijn. Wit of kleurloos betekent dat bij de strip anaerobe redoxomstandigheden zijn bereikt. Sommige commerciële indicatorpapieren bevatten een rood achtergrondpigment, waardoor hun gereduceerde eindpunt roze is in plaats van wit. Weet welk eindpunt jouw product hoort te geven voordat je het beoordeelt.

De timing verschilt per systeem. In één opstelling van het GasPak-type begon de kleur binnen ongeveer een uur te vervagen en was de ontkleuring binnen enkele uren voltooid. Bij een gecontroleerde vergelijking op kamertemperatuur had methyleenblauw daarentegen meer dan zes uur nodig. De redoxpotentiaal van de kweekmedia bereikte in dat onderzoek binnen 60 tot 100 minuten ongeveer min 100 millivolt, ruim voordat de kleurstof klaar was met verkleuren, en lag ruim onder min 200 millivolt toen de strip volledig kleurloos werd. De indicator loopt achter op de atmosfeer. Een blauwe strip na één uur bewijst geen mislukking, en een witte strip na zes uur beschrijft de toestand van de strip na zes uur.

Om dezelfde reden is de plaatsing belangrijk. Houd de strip in de gasruimte boven de kweken, zichtbaar door het deksel, en uit de buurt van agaroppervlakken en kweekmedia. Hij geeft zijn directe omgeving weer. Leg je hem plat tegen een koude wand, stop je hem onder platen of laat je hem doorweken met condensaat, dan geeft hij dat micromilieu weer in plaats van de omstandigheden in de pot.

Wat de strip laat zien en wat niet

Beschouw de methyleenblauw-indicator in de anaerobe kweekpot als één sensor op één plek. Hij stelt de lokale redox- en zuurstofomstandigheden in zijn eigen reactiezone vast. Bij voldoende menging en evenwichtsinstelling zijn die in grote lijnen representatief voor de gasruimte. Alles daarbuiten is een gevolgtrekking, en een gevolgtrekking vereist afzonderlijk bewijs.

Een kleurloze strip toont geen steriliteit aan. Steriliteit is de afwezigheid van levensvatbare organismen, aangetoond met gevalideerde sterilisatie en controles voor kweekvalidatie. Een pot kan volledig anaeroob zijn en toch besmet, of volledig steriel en toch aeroob.

De strip valideert niet elk onderdeel van het kweeksysteem. Opgeloste zuurstof in een afgesloten buis, zuurstof die in diepe agar is ingesloten, gradiënten in een volle pot en een lek dat na de aflezing ontstaat, vallen allemaal buiten het bereik van één strip. Ruimtelijke experimenten lieten naast elkaar gelegen blauwe en kleurloze zones in hetzelfde vat zien, waar zuurstofpenetratie en reducerende activiteit op verschillende manieren in evenwicht waren. Eén meetpunt kan geen heel volume certificeren.

De strip bewijst ook geen ononderbroken anaerobiose. Een strip die één keer bij het opzetten wordt afgelezen, zegt niets over het twintigste uur. Recent onderzoek naar kwaliteitsborging bij anaerobe kweek waarschuwt dat chemische indicatoren de atmosfeer beschrijven op het moment van aflezen en er goed kunnen uitzien ondanks een lage restconcentratie zuurstof. Doorlopende registratie of registratie op vaste controlemomenten, niet één blik op het eindpunt, verbindt de strip met de incubatie.

Zie voor de bijbehorende chemie achter de kleurverandering hoe methyleenblauw wisselt tussen geoxideerde en gereduceerde toestanden. Zie voor de bredere invloed van zuurstof op het omgaan met monsters de informatie over zuurstofbeheersing bij microscopie en kweekwerk.

Een schema om naast de pot te bewaren

De onderstaande afbeelding vat het artikel samen als naslagkaart voor de werkbank. Drie toestanden van dezelfde strip, de twee richtingen van de reactie en de grens tussen wat de indicator aantoont en validatie van het systeem.

Faalwijzen die de strip blauw houden of ten onrechte geruststellen

De meeste problemen vallen in vijf groepen. Elke groep heeft een herkenbaar patroon.

Een lekkende pot of zak blijft zuurstof aan de reactiezone toevoeren. De strip blijft blauw of wordt na het vervagen weer blauw. Controleer het deksel, de pakking, de klemmen en de afdichtingsvlakken voordat je de chemie de schuld geeft.

Een uitgeputte of verkeerd geactiveerde gasgenerator verwijdert de zuurstof niet. Bij oudere, door water geactiveerde systemen waren het ontbreken van condensatie rond 10 tot 15 minuten en het uitblijven van opwarming van het deksel rond 20 tot 40 minuten vroege waarschuwingssignalen voor dat systeem. Een sachet met te weinig capaciteit in een te vol beladen pot faalt op dezelfde manier.

Een vergiftigde katalysator speelt alleen een rol bij oudere systemen met waterstof en palladium, waarin palladium waterstof en zuurstof tot water laat reageren. Vocht en waterstofsulfide tasten de katalysator aan. Veel huidige sachets gebruiken helemaal geen palladium, dus pas deze oplossing niet toe waar die niet van toepassing is.

Een aangetaste of verkeerd behandelde strip faalt zonder duidelijke waarschuwing. Kleurstof en reductiemiddel verliezen tijdens opslag hun omkeerbaarheid. Dat is een van de redenen waarom hybride formuleringen zijn ontwikkeld die bestand zijn tegen lichtverbleking en kwaliteitsverlies tijdens opslag. Keur voorraad af die over de houdbaarheidsdatum is, een afwijkende beginkleur heeft, of strips bevat die zijn bevochtigd terwijl ze droog moeten blijven of droog zijn gebleven terwijl ze bevochtigd moeten worden.

Een gradiënt of vertraging misleidt de aflezer, niet de chemie. Een slecht gemengde gasruimte, afgesloten buizen met opgeloste zuurstof en halfvaste media behouden elk hun eigen omstandigheden langer dan de strip doet vermoeden. Resazurinestrips worden via roze kleurloos en worden vaak als sneller aangeprezen, maar hun drempelwaarden horen bij hun eigen formulering en zijn niet overdraagbaar op methyleenblauw.

Controles en een afleesprotocol om over te nemen

Twee goedkope controles ondervangen de meeste verkeerde aflezingen. Houd naast de kweekronde een verse controlestrip in de omgevingslucht. Een werkende methyleenblauwstrip blijft daar blauw. Sommige verpakte indicatoren zijn aanvankelijk bleek en worden bij het openen blauw, wat op zichzelf een functiecontrole is. Plaats daarnaast periodiek een verse strip in een eerder gevalideerde anaerobe opstelling. Die moet binnen de door het product voorgeschreven tijd het gevalideerde gereduceerde eindpunt bereiken. Als een van beide controles niet naar verwachting reageert, vervang dan de partij voordat je op de aflezingen in de pot vertrouwt.

Het afleesprotocol volgt uit het mechanisme. Plaats de strip zo dat hij in de gasruimte zichtbaar is zonder de pot te openen, en volg de productinstructies voor contact met de wand en bevochtiging. Registreer de beginkleur, het tijdstip waarop de pot werd afgesloten en de kleur op het door het product voorgeschreven controlemoment. Leg, waar het vat dat toelaat, op vastgestelde controlemomenten tijdens de incubatie vast dat de indicator gereduceerd is gebleven. Registreer de eindkleur vlak vóór het openen. Die kleur vóór het openen is het eindpunt voor die kweekronde. Verwacht na het openen dat de strip weer blauw wordt en laat dat de eerdere registratie niet veranderen.

Blijft de strip na de voorgeschreven tijd blauw, beschouw de anaerobiose dan als niet bevestigd. Loop de keten in volgorde na: afdichting, sachet, katalysator indien aanwezig, bevochtiging en houdbaarheid van de indicator, en vervolgens de werking van de indicator aan de hand van de luchtcontrole. Pas wanneer de atmosfeer is geverifieerd, mag groei of het uitblijven daarvan worden geïnterpreteerd, met een anaerobe kweekopstelling en controles met organismen die bij de toepassing passen.

Binnen zijn eigen domein verdient de strip het laatste woord. Blauw of kleurloos: hij beantwoordt één vraag over één plek op één moment. Stel hem die vraag op de afgesproken tijdstippen, met controles ernaast, en hij antwoordt betrouwbaar. Vraag hem naar steriliteit, naar elke buis of naar de volledige incubatie op basis van één blik, en geen enkele indicatorchemie kan de interpretatie redden.