Loefflers alkalische en polychrome methyleenblauwkleuringen uitgelegd

Op een kleuringstafel kunnen drie flessen naast elkaar staan, elk met een variant van methyleenblauw op het etiket. Op de ene staat waterig methyleenblauw 1%. Op de andere staat Loefflers alkalisch methyleenblauw. Op de derde staat polychroom methyleenblauw. Een drukke medewerker pakt de dichtstbijzijnde fles. Het uitstrijkje kleurt vervolgens te zwak, te gelijkmatig blauw of in onverwachte paarstinten, en het monster krijgt de schuld.

Dit is een probleem met de formulering, niet met het monster. De drie oplossingen bevatten verwante kleurstoffen, maar vertegenwoordigen verschillende kleuringsprincipes. De ene is een gewone kationische kleurstof bij een vrijwel neutrale pH. De andere is dezelfde kleurstof, waarvan de werking door alkali wordt versterkt. De derde is helemaal geen afzonderlijke kleurstof meer, maar een bewust geoxideerd mengsel. Gebruik je de verkeerde, dan verandert het kleuringsprincipe terwijl je ermee werkt.

Het korte antwoord

Gewoon waterig methyleenblauw is het uitgangspunt: ongeveer 1% kleurstof in water, een eenvoudige kationische kleuring voor bacteriële morfologie en algemene microscopie. Bij Loefflers alkalisch methyleenblauw wordt een kleine, afgemeten hoeveelheid verdund alkali toegevoegd aan een alcoholische voorraadoplossing die met water is verdund. Dit verhoogt de pH en versterkt de binding van de kationische kleurstof aan zure bacteriële structuren. Polychroom methyleenblauw is methyleenblauw dat bewust door oxidatie in alkali is gerijpt. Daardoor bevat de fles een mengsel van gedemethyleerde homologen (azure A, azure B, azure C), thionine en methyleenviolet, naast resterend methyleenblauw. Dat mengsel kleurt verschillende structuren in verschillende tinten.

Als je maar één zin onthoudt: alkalisering verandert de kleuringsintensiteit, terwijl polychromering de kleuren van de kleuring verandert.

Gewoon waterig methyleenblauw: het referentiepunt

De eenvoudigste formulering is methyleenblauw opgelost in water, doorgaans bij 1% w/v, zonder alkali en zonder oxidatie. De gekleurde component is het methylthioniniumkation met een chloride-tegenion, een kleine, vlakke fenothiazinekleurstof die in de PubChem-vermelding voor methyleenblauw wordt beschreven als methylthioniniumchloride. Als kation bindt het aan de fosfaatruggengraat van nucleïnezuren en aan zure groepen op bacteriële celwanden, waardoor cellen blauw kleuren tegen een lichte achtergrond.

Het voordeel is de voorspelbaarheid. Celkernen en bacteriën zien er blauw uit. Het contrast is bescheiden. Moeilijk zichtbare organismen kunnen zwak kleuren, precies de beperking die Loeffler wilde verhelpen. Voor de bredere groep eenvoudige bacteriële kleuringen waartoe deze oplossing behoort, kun je een overzicht van eenvoudige bacteriële kleuring raadplegen. Ook hier blijft het belangrijk de identiteit zorgvuldig te controleren: methylblauw is een volledig ander molecuul, zoals methylblauw versus methyleenblauw uitlegt. Wie in een catalogus alleen op de kleurnaam zoekt, kan dus bij de verkeerde kleurstofklasse uitkomen.

Loefflers alkalisch methyleenblauw: dezelfde kleurstof, met versterkte werking

Het klassieke recept van Loeffler combineert een alcoholische methyleenblauwvoorraadoplossing met verdund alkali in water. Leerboekversies schrijven 0.3 g kleurstof in 30 mL 95% ethanol plus 100 mL 0.01% waterig kaliumhydroxide voor (of, als equivalent, 30 mL verzadigd alcoholisch methyleenblauw, 100 mL gedestilleerd water en 1 mL 1% KOH). Dit levert een werkoplossing op met ongeveer 0.3% kleurstof bij een duidelijk alkalische pH. Commerciële versies volgen hetzelfde principe. De catalogus met microbiologische kleurstoffen van Thermo Fisher vermeldt Loefflers alkalisch methyleenblauw naast polychrome en waterige varianten als afzonderlijke catalogusartikelen met verschillende beoogde toepassingen.

Het alkali is de kern van het principe. Door de pH te verhogen, worden carboxyl- en fosfaatgroepen op het preparaat gedeprotoneerd, waardoor de dichtheid van negatief geladen bindingsplaatsen toeneemt. De alcoholische voorraadoplossing houdt de kleurstof volledig opgelost, zodat die deze plaatsen in monomere vorm bereikt. Het resultaat is een snellere en intensere kleuring van bacteriën dan met een neutrale waterige kleurstof, met de vertrouwde diepblauwe staafjes en kokken van een routinematig bacteriologisch uitstrijkje. De kleuringstijd is doorgaans één tot drie minuten, gevolgd door spoelen met water.

De klassieke toepassing is Corynebacterium diphtheriae gekweekt op Loefflers serummedium: slanke, vaak knotsvormige staafjes met sterk gekleurde metachromatische Babes-Ernst-granula van opgeslagen polyfosfaat. De combinatie van medium en kleuring is historisch; beide worden aan dezelfde bacterioloog toegeschreven. Het contrast van de granula levert de diagnostische meerwaarde. Naast onderzoek naar difterie dient de kleuring als algemene bacteriologische kleuring voor uitstrijkjes van kweken, voor de morfologie van Neisseria in klinische uitstrijkjes en overal waar een Gramkleuring niet nodig is, maar gewoon waterig blauw te zwak blijkt. Het is een monochrome kleuring. Alles wat zuur is, krijgt een tint blauw. Als een protocol kleuronderscheid vereist, kan alkali alleen dat niet bieden.

Een praktische waarschuwing: alkalische kleurstofoplossingen gaan tijdens opslag en door opname van koolstofdioxide achteruit en vormen neerslag. Laboratoria bereiden daarom bescheiden volumes of kopen de catalogusoplossing en houden zich aan de houdbaarheid, in plaats van een oude fles te blijven gebruiken die inmiddels sediment op elk objectglaasje achterlaat.

Polychroom methyleenblauw: één naam, meerdere kleurstoffen

Polychroom methyleenblauw begint met dezelfde kleurstof, maar onderwerpt die aan gecontroleerde oxidatie in alkali, historisch rijping of polychromering genoemd. Alkalische veroudering, verhitting met carbonaat of oxidatie met middelen zoals dichromaat verwijdert stapsgewijs methylgroepen van de dimethylaminosubstituenten. Het product is een mengsel: resterend methyleenblauw plus azure B (één methylgroep verwijderd), azure A en azure C (verdere demethylering), thionine (volledig gedemethyleerd) en oxidatieve bijproducten uit de methyleenvioletfamilie. Elke component heeft een eigen tint en affiniteit voor weefsels. Het mengsel kleurt daardoor metachromatisch: celkernen, granula, mucinen en kraakbeen krijgen elk kenmerkende blauwe tot roodpaarse tinten.

Deze chemie ligt ook ten grondslag aan de bekende bloedkleuringen. Vroege onderzoekers ontdekten dat gealkaliseerd methyleenblauw de kernen van malariaparasieten in paarstinten kleurde, maar hun waterige gerijpte oplossingen waren instabiel en vormden binnen enkele dagen neerslag. Het overzicht van hoe de paarse bloedkleuring werd uitgevonden beschrijft hoe Malachowski en Romanowsky dit effect in 1891 onafhankelijk van elkaar benutten, hoe methanol werd ingevoerd om het kleurstofneerslag te stabiliseren en uitstrijkjes zonder verhitting te fixeren, en hoe Giemsa het mengsel later standaardiseerde rond afgemeten hoeveelheden azure B plus eosine, met glycerol als stabilisator. Moderne Giemsa-achtige kleuringen stammen rechtstreeks af van polychroom methyleenblauw plus eosine, de combinatie die het Romanowsky-effect veroorzaakt. Voor meer informatie over de combinatie met eosine en de azure B-component, zie Romanowsky-achtige kleuringen en de interactie tussen azure B en eosine.

Omdat het een mengsel is, is polychroom methyleenblauw van nature het minst gestandaardiseerd van de drie. De precieze balans tussen de tinten hangt af van de oxidatieroute en de mate van oxidatie. Daarom verkopen leveranciers voor histologie het als een afzonderlijk product met eigen prestatietests, en niet als verouderd Loefflers methyleenblauw. Typische toepassingen zijn het metachromatisch aantonen van mestcelgranula, mucinen en kraakbeen, het zichtbaar maken van details van plasmacellen en het aantonen van Helicobacter pylori in weefselcoupes met polychrome methoden van het Goodpasture-type. Het is de juiste keuze wanneer kleuronderscheid nodig is, en de verkeerde keuze wanneer het protocol een duidelijk monochroom bacterieel silhouet verwacht.

Vergelijking van formuleringen en toepassingen

Gebruik de tabel als keuzehulp. Als het preparaat te zwak kleurt, verander dan de pH-benadering en kies Loefflers methyleenblauw. Als alles kleurt maar niets zich onderscheidt, verander dan het kleurstofprincipe en kies polychroom methyleenblauw. Als een met Loefflers methyleenblauw gekleurd uitstrijkje de granula prachtig toont, maar de leidinggevende vraagt waarom celkernen en cytoplasma dezelfde blauwe kleur hebben, is het antwoord dat geen enkele alkalische monochrome kleuring dat onderscheid kan maken. Die vraag hoort bij de polychrome familie en de daarvan afgeleide bloedkleuringen.

Veelvoorkomende verwisselingen voorkomen

Twee fouten verklaren het grootste deel van de verwarring. De eerste is Loefflers methyleenblauw als uitwisselbaar met gewoon methyleenblauw beschouwen, omdat beide er in de fles blauw uitzien. Ze verschillen in pH en intensiteit. Als je een neutrale kleurstof gebruikt waar Loefflers methyleenblauw is voorgeschreven, verlies je precies het granulacontrast waarop het protocol is afgestemd. De tweede is elk oud of onbedoeld verouderd alkalisch blauw als polychroom beschouwen. Ongecontroleerde veroudering levert een onbekend mengsel met een onbekende sterkte op, terwijl echte polychrome oplossingen via vastgelegde oxidatieroutes worden bereid en, binnen de traditie van bloedkleuringen, met afgemeten hoeveelheden eosine worden gecombineerd. De geschiedenis is hier leerzaam: de instabiele waterige gerijpte oplossingen uit de jaren 1890 maakten plaats voor gestabiliseerde formuleringen in methanol, juist omdat ongecontroleerde mengsels niet reproduceerbaar waren. Die les is het overdenken waard voordat je een diagnostisch preparaat kleurt uit een fles waarvan de ouderdom onzeker is.

Zorgvuldigheid bij de benaming maakt het geheel sluitend. Controleer op het etiket het catalogusartikel (waterig, Loeffler of polychroom), het kleurstofgehalte en de beoogde toepassing, in plaats van deze uit de kleur af te leiden. De drie formuleringen hebben een gemeenschappelijke chromofore oorsprong. Ze hebben niet hetzelfde doel.