लेख
मिथिलिन ब्लु र कोशिकीय जीर्णावस्था: फाइब्रोब्लास्ट प्रयोगहरूले के मापन गर्छन्
एउटा सामान्य गलत बुझाइ यस्तो हुन्छ। कुनै शोधपत्रले कल्चरमा हुर्काइएका फाइब्रोब्लास्टमा मिथिलिन ब्लुले कोशिका जनसंख्या दोब्बर हुने 20 भन्दा बढी अतिरिक्त चक्र थपेको बताउँछ, अनि पाठकले यसले जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिका हटाउँछ वा मानिसको आयु पनि त्यस्तै अनुपातमा बढाउँछ भन्ने निष्कर्ष निकाल्छ। यस्तो अनुमान स्वाभाविक लाग्छ। तर यो दुई अलग बिन्दुमा गलत छ।
मुख्य समस्या संख्यामा होइन, अवधारणामा छ। कोशिका जनसंख्या दोब्बर हुने चक्र, जीर्णावस्थाका चिह्नक र टेलोमियरका मापनले फरक-फरक प्रश्नको उत्तर दिन्छन्। मिथिलिन ब्लुसम्बन्धी फाइब्रोब्लास्ट अनुसन्धानलाई प्रयोगशालाको डिशमा रहेको एउटै कोशिका प्रकारमा जीर्णावस्थाको प्रवेश ढिलो भएको अध्ययनका रूपमा बुझ्नु उपयुक्त हुन्छ, जसलाई माइटोकन्ड्रियाका मापनले समर्थन गर्छन्। यो पहिले नै जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिकालाई छानेर हटाउनुभन्दा फरक हो, र जीवको बुढ्यौलीभन्दा पनि फरक हो। यस भिन्नताको व्यापक सन्दर्भ माइटोकन्ड्रियाको इलेक्ट्रोन परिवहनले कोशिकाको ऊर्जालाई कसरी आकार दिन्छ र मिथिलिन ब्लुसम्बन्धी अनुसन्धानका दाबी कसरी बुझ्ने भन्ने विषयसँग जोडिएको छ।
जनसंख्या दोब्बर हुने चक्रले इतिहास गन्छन्, युवावस्था होइन
धेरैजसो प्रमुख नतिजा IMR90 कोशिकाबाट आएका हुन्। यो मानव भ्रूणको फोक्सोबाट प्राप्त सामान्य फाइब्रोब्लास्ट कोशिका स्ट्रेन हो, जसको विभाजन क्षमता सीमित हुन्छ। IMR90 फाइब्रोब्लास्टमा मिथिलिन ब्लु र विभाजनगत आयुसम्बन्धी प्रारम्भिक अध्ययनमा कल्चरलाई निश्चित तालिकाअनुसार नयाँ माध्यममा सारियो र कल्चरको विभाजन रोकिनेसम्म जनसंख्या दोब्बर हुने सञ्चित चक्र अभिलेख गरियो। 100 nM लाई केन्द्रमा राखेर नानोमोलर स्तरमा गरिएको उपचारले विभाजन रोकिनुअघि कल्चरमा 20 भन्दा बढी अतिरिक्त दोब्बर हुने चक्र सम्भव बनायो।
जनसंख्या दोब्बर हुने चक्र हिसाब राख्ने एकाइ हो। यसले जनसंख्या लगभग कति पटक दोब्बर भयो भन्ने अभिलेख गर्छ। यसले कुनै व्यक्तिगत कोशिका जीर्णावस्थामा छ, अस्थायी निष्क्रिय अवस्थामा छ, विभेदित छ वा मरेको छ भन्ने प्रत्यक्ष रूपमा बताउँदैन। कोशिका लामो समयसम्म विभाजन गर्न सक्षम रहँदा, तनावका कारण चाँडै विभाजन रोकिने कोशिका कम हुँदा, वा परिस्थितिले वृद्धि गर्न सक्ने कुनै उपजनसंख्यालाई छानेर अनुकूल बनाउँदा कल्चरमा दोब्बर हुने चक्र थपिन सक्छन्। गणनाले मात्र यी प्रक्रियालाई छुट्याउन सक्दैन।
त्यसैले दोब्बर हुने चक्रको गणनासँगै चिह्नकहरू पनि हेरिन्छन्। गणनाले कोशिका वृद्धि कति लामो समय चल्यो भन्ने बताउँछ। चिह्नकहरूले विभाजन रोकिएका वा बाँचेका कोशिका कुन अवस्थामा पुगे भन्ने बताउँछन्।
मापन सूचकहरूको मार्गदर्शिका: प्रत्येक चिह्नकले के बताउँछ
कल्चरमा जीर्णावस्था विभिन्न स्वतन्त्र मापनबाट पहिचान गरिने लक्षणसमूह हो। कुनै एउटा रञ्जन वा प्रोटिनले मात्र यसलाई प्रमाणित गर्दैन।
DNA संश्लेषण घटेसँगै वृद्धि रोकिनु। BrdU वा EdU समावेशनमा कमी, च्याप्टो आकृति र पुनः कल्चरमा राखेपछि फेरि वृद्धि हुन नसक्ने अवस्थाबाट दीर्घकालीन अवरोध जाँचिन्छ। यसले जीर्णावस्थाका कारण भएको विभाजन अवरोधलाई अस्थायी निष्क्रियताबाट छुट्याउँछ।
जीर्णावस्थासँग सम्बन्धित बीटा ग्याल्याक्टोसिडेज। SA-beta-gal रञ्जनले pH 6.0 नजिकको लाइसोसोम गतिविधि देखाउँछ। लाइसोसोमको कुल मात्रा बढ्दै जाँदा जीर्णावस्थामा पुगेका फाइब्रोब्लास्टमा प्रायः सकारात्मक रञ्जन देखिन्छ। यो जीर्णावस्थाका लागि मात्र विशिष्ट हुँदैन, त्यसैले यसलाई कोशिका वृद्धि र आणविक चिह्नकसँगै व्याख्या गरिन्छ।
p16 र p21 मार्गहरू। p16 ले CDK4, CDK6 र RB मार्गमार्फत काम गर्छ। p21 प्रायः p53 मार्फत प्रेरित हुन्छ। यी प्रोटिनको बढ्दो स्तरले विभाजन अवरोधलाई समर्थन गर्छ, तर दुवै प्रोटिन जीर्णावस्थामा मात्र सीमित हुँदैनन्।
स्रावी अवस्था। जीर्णावस्थासँग सम्बन्धित स्रावी लक्षणसमूह, अर्थात् SASP, ले साइटोकाइन, केमोकाइन, वृद्धि कारक र प्रोटिएजको स्रावमा आएको परिवर्तन जनाउँछ। SASP कारकका RNA वा प्रोटिन परीक्षणले कोशिकाले छिमेकी कोशिकालाई कसरी संकेत दिन्छन् भन्ने वर्णन गर्छन्। तिनले विभाजन क्षमता प्रत्यक्ष रूपमा मापन गर्दैनन्।
अक्सिडेन्ट र माइटोकन्ड्रियाका मापनहरू। मिथिलिन ब्लुसम्बन्धी शोधपत्रहरूले माइटोकन्ड्रियाको पक्ष पनि थप्छन्: कम्प्लेक्स IV को मात्रा र गतिविधि, अक्सिजन खपत, हीम संश्लेषण, झिल्लीको कुल मात्रा, झिल्ली विभव, ATP र अक्सिडेन्ट संकेतहरू। यिनले विभाजन ढिलो रोकिनेसँग जोडिएको चयापचयी अवस्था वर्णन गर्छन्। यी आफैंले जीर्णावस्था परिभाषित गर्दैनन्, तर प्रस्तावित क्रियाविधि जाँच्छन्। NAD(P)H ले मिथिलिन ब्लुलाई अपचयन गर्ने र साइटोक्रोम c ले यसलाई पुनः अक्सिकरण गर्ने रेडक्स चक्रणको नमुना सोही रेडक्स चक्रणलाई कम अक्सिडेन्ट उत्पादनसँग जोड्ने IMR90 अध्ययनमा प्रस्तुत गरिएको छ। मात्रा र वितरणसम्बन्धी तर्क मिथिलिन ब्लुको औषधिविज्ञान र तन्तुमा हुने सम्पर्कसम्बन्धी विषयमा समेटिएको छ।
टेलोमियर क्षयको दर। सही एकाइ भनेको हप्तौँको अवधिमा प्रत्येक दोब्बर हुने चक्रमा गुमेका बेस पेयर हुन्, कुनै एक समयबिन्दुको लम्बाइ होइन। क्षय ढिलो हुनुको अर्थ प्रत्येक प्रतिकृति निर्माणमा कम छोटिनु हो। यसको अर्थ लम्बाइ बढ्नु होइन, र तनावले टेलोमियरमा थोरै परिवर्तन हुँदा पनि IMR90 कोशिकाको विभाजन रोक्न सक्छ।
तीन फाइब्रोब्लास्ट प्रयोग ढाँचाको तुलना
यस पृष्ठको मौलिक सामग्री तलको तुलना हो। यसले कोशिका प्रकार, सम्पर्क, मापन र सीमालाई एउटै दृश्यमा राख्छ।
| अध्ययन | कोशिका र सम्पर्क | के मापन गरियो | यसले के देखाउन सक्दैन |
|---|---|---|---|
| Atamna र सहकर्मी, FASEB J 2008 | सामान्य IMR90 फाइब्रोब्लास्ट, दीर्घकालीन नानोमोलर मिथिलिन ब्लु, मानक अवस्थाका रूपमा 100 nM | सञ्चित दोब्बर हुने चक्र, कम्प्लेक्स IV को मात्रा, अक्सिजन खपतमा 37 देखि 70 प्रतिशत वृद्धि, हीम संश्लेषण, हाइड्रोजन पेरोक्साइड वा क्याड्मियमले उत्पन्न गरेको समयपूर्व जीर्णावस्थाबाट जोगावट, HepG2 कोशिकामा चरण 2 का एन्जाइम | जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिका हटाउने परीक्षण छैन। जनावर वा मानिसको दीर्घायुसम्बन्धी मापन सूचक छैन। यहाँ विभाजनगत आयु भन्नाले डिशमा दोब्बर हुने चक्र बुझिन्छ। |
| Atamna र सहकर्मी, Redox Biology 2015, AMPK र कम्प्लेक्स IV को जैवउत्पत्तिसम्बन्धी पछिल्लो क्रियाविधि अध्ययनमा वर्णित | IMR90 फाइब्रोब्लास्ट, मुख्यतः 100 nM मिथिलिन ब्लु, तुलना गर्न दीर्घकालीन AMPK सक्रियकर्ताका रूपमा AICAR | समयसँगै NAD र NADH को अनुपात, क्षणिक AMPK फस्फोरिलेसन, PGC-1alpha र SURF1 को प्रेरण, कम्प्लेक्स IV गतिविधिमा 100 प्रतिशतभन्दा बढी वृद्धि, 28 प्रतिशत कम अक्सिडेन्ट, टेलोमियर क्षय ढिलो हुनु, AICAR सँग लगभग 2 को तुलनामा लगभग 18 अतिरिक्त दोब्बर हुने चक्र, कोशिका चक्रमा प्रभाव नदेखिनु | AICAR को तुलनात्मक मात्रा लगभग 1000 गुणाले फरक छ र यसको विशिष्टता पनि फरक छ, त्यसैले यसले समान प्रभावक्षमताभन्दा सक्रियताको ढाँचा जाँच्छ। टेलोमियरको नतिजा हप्तौँसम्म विभाजन भइरहेका कल्चरमा लागू हुन्छ। |
| Xiong र सहकर्मी, Aging Cell 2016, माइटोकन्ड्रिया र केन्द्रकको सुधारसम्बन्धी प्रोजेरिया फाइब्रोब्लास्ट अध्ययनमा प्रकाशित | हचिन्सन–गिलफोर्ड प्रोजेरियाका प्राथमिक छाला फाइब्रोब्लास्ट र मिल्दो सामान्य नियन्त्रण कोशिका, अधिकांशतः 5 देखि 12 हप्तासम्म 100 nM | फ्लोरेसेन्स र इलेक्ट्रोन माइक्रोस्कोपीबाट माइटोकन्ड्रियाको आकार, जीवित कोशिकाको चित्रणबाट गतिशीलता, सुपरअक्साइड, झिल्ली विभव, ATP, PGC-1alpha, कोशिका वृद्धि र जीर्णावस्थाका चिह्नक, साथै केन्द्रकमा फोका-जस्ता उभार, प्रोजेरिनको स्थान, हेटेरोक्रोमाटिन र जीन अभिव्यक्ति | रोगविशिष्ट समयपूर्व बुढ्यौलीको नमुना हो, सामान्य बुढ्यौली होइन। आकृति र चिह्नकमा सुधार आउनु जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिका हट्नु होइन। जनावरमा प्रभावकारिता वा क्लिनिकल मापन सूचक छैन। |
| Xue र सहकर्मी, Cells 2021 समीक्षा, बुढ्यौलीविरोधी सम्भावित यौगिकका रूपमा मिथिलिन ब्लुको समीक्षामा सारांशित | मस्तिष्कको बुढ्यौली, स्नायु अपक्षय, छाला, घाउ निको हुने प्रक्रिया र प्रोजेरियासम्बन्धी साहित्यको संश्लेषण | बुढ्यौलीका मुक्त रेडिकल सिद्धान्तको सन्दर्भमा मिथिलिन ब्लुलाई कम्प्लेक्स I र III को इलेक्ट्रोन प्रवाहका केही भागलाई बाइपास गर्न सक्ने उत्प्रेरकीय रेडक्स चक्रण गर्ने पदार्थका रूपमा प्रस्तुत गर्छ | वर्णनात्मक संश्लेषण मात्र हो। यसले परिकल्पनाहरू व्यवस्थित गर्छ र क्लिनिकल प्रमाण कहाँ अनिर्णीत छन् भन्ने उल्लेख गर्छ। |
कुनै एउटा पङ्क्तिभन्दा सबै पङ्क्तिमा देखिने ढाँचा बढी महत्त्वपूर्ण छ। कम मात्राको मिथिलिन ब्लु बारम्बार लामो कोशिका वृद्धि अवधि, उच्च कम्प्लेक्स IV गतिविधि, कम अक्सिडेन्ट संकेत र सुधारिएको आकृतिसँग सम्बन्धित देखिन्छ। प्रयोगको ढाँचा समयक्रमिक रहन्छ: विभाजन भइरहेका कोशिकाबाट सुरु गर्ने, विस्तार भइरहँदा उपचार गर्ने र विभाजन कति समय जारी रहन्छ भन्ने अभिलेख गर्ने। यस संरचनाले जीर्णावस्था ढिलो हुने दाबीलाई समर्थन गर्न सक्छ। फरक प्रयोग ढाँचाबिना यसले कोशिका हटाउने दाबीलाई समर्थन गर्न सक्दैन।
जीर्णावस्था ढिलो पार्नु भनेको जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिका हटाउनु होइन
ढिलो पार्नुको अर्थ विभाजन भइरहेका कोशिका विभाजन रोकिनुअघि अझ लामो समयसम्म विभाजित भइरहनु हो। हटाउनु, जसलाई प्रायः सेनोलाइटिक प्रभाव भनिन्छ, भनेको छिमेकी वृद्धि भइरहेका कोशिका जीवित रहँदा पहिले नै जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिकालाई छानेर मार्नु वा तिनको संख्या घटाउनु हो।
मिथिलिन ब्लुसम्बन्धी फाइब्रोब्लास्ट साहित्यले पहिलो ढाँचा जाँच्छ। कल्चर सुरुमा वृद्धि भइरहेका हुन्छन्, क्रमिक रूपमा नयाँ माध्यममा सार्दा उपचार पाउँछन् र पछि मात्र विभाजन रोकिन्छ। त्यसैले SA-beta-gal, p16, p21 र SASP कारकजस्ता चिह्नक ढिलो देखा पर्छन् वा नयाँ माध्यममा सारेको कुनै निश्चित चरणमा कम स्तरमा देखिन्छन्। जीर्णावस्थाको सुरुआत पछाडि सर्दा यस्तो ढाँचा अपेक्षित हुन्छ। यसले पहिले नै जीर्णावस्थामा पुगेको कुनै कोशिका हटाइएको प्रमाणित गर्दैन।
सेनोलाइटिक दाबीका लागि फरक व्यवस्था चाहिन्छ: पहिले कल्चरलाई प्रमाणित जीर्णावस्थामा पुर्याउने, त्यसपछि यौगिक प्रयोग गर्ने, अनि वृद्धि भइरहेका नियन्त्रण कोशिकाको तुलनामा ती जीर्णावस्थाका कोशिका छानेर घटेको देखाउने, साथै जीवितता र मृत्युका प्रत्यक्ष मापन गर्ने। कुनै चिह्नकमा मात्र आएको कमी पर्याप्त हुँदैन, किनकि कोशिका नगुमाई पनि अभिव्यक्ति बदलिन सक्छ, र बाँकी वृद्धि भइरहेका कोशिकाले डिश भरिन सक्छ। उद्धृत चार स्रोतहरूमध्ये कुनैले पनि मिथिलिन ब्लुका लागि यस्तो चयनात्मक कोशिका घटाउने ढाँचा प्रयोग गरेको छैन। त्यसैले सही नाम अझै पनि प्रयोगशालामा देखिएको जीर्णावस्था ढिलो पार्ने वा जीर्णावस्थाविरोधी गतिविधि हो, सेनोलाइटिक होइन। यस भिन्नताको अक्सिडेटिभ तनावसम्बन्धी पक्ष कोशिकाले प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरूलाई कसरी नियन्त्रण गर्छन् भन्ने लेखमा थप स्पष्ट गरिएको छ।
क्षणिक संकेतसम्बन्धी नतिजाले यो कुरा अझ स्पष्ट पार्छ। 2015 को IMR90 अनुसन्धानमा मिथिलिन ब्लुले NAD र NADH को अनुपातमा छोटो समयका लागि वृद्धि र क्षणिक AMPK फस्फोरिलेसन गरायो, त्यसपछि कम्प्लेक्स IV को जैवउत्पत्तिसँग सम्बन्धित PGC-1alpha र SURF1 दुवैको प्रेरण भयो। AICAR बाट दीर्घकालीन AMPK सक्रिय गर्दा अतिरिक्त दोब्बर हुने चक्रको नतिजा निकै कमजोर रह्यो।
विभाजनगत आयु भनेको मानिसको दीर्घायु होइन
कोशिकाको विभाजनगत आयुले निश्चित अक्सिजन, माध्यम र नयाँ माध्यममा सार्ने ताल भएको नियन्त्रित डिशमा विभाजन रोकिनुअघिका दोब्बर हुने चक्र गन्छ। मानिसको दीर्घायुमा दशकौँको विकास, प्रतिरक्षा, रक्तनली संरचना, स्टेम कोशिकाका सूक्ष्मपरिवेश, व्यवहार र रोग समेटिन्छन्। कुनै यौगिकले दोस्रोमा परिवर्तन नल्याई पहिलो बढाउन सक्छ, र धेरैजसोले त्यसै गर्छन्।
प्रोजेरियाका फाइब्रोब्लास्टमा प्रोजेरिन उत्पादन गर्ने निश्चित LMNA उत्परिवर्तन हुन्छ। तिनमा टुक्रिएका र कम गतिशील माइटोकन्ड्रिया, कम ATP, विकृत आकारका केन्द्रक र हेटेरोक्रोमाटिनको ह्रास हुन्छ। नानोमोलर मिथिलिन ब्लुले माइटोकन्ड्रियाका मापनमा सुधार ल्यायो र झिल्लीबाट प्रोजेरिन छुट्टिनेसहित केन्द्रकका मापनमा उल्लेखनीय सुधार गर्यो। यो कोशिकास्तरमा देखिएको प्रभावशाली सुधार हो। तर यो अझै फाइब्रोब्लास्टकै नतिजा हो, र लेखकहरूले जनावरमा परीक्षणलाई भविष्यको कामका रूपमा राखेका थिए। रोगको यस नमुनाबारे प्रोजेरिया र समयपूर्व बुढ्यौलीका नमुनामा मिथिलिन ब्लु भन्ने लेखमा थप चर्चा गरिएको छ।
यसबाट अध्ययन पढ्दा उपयोगी हुने निम्न जाँचसूची तयार हुन्छ।
- उपचार विभाजन रोकिनुअघि सुरु भयो कि विभाजन रोकिएको अवस्था स्थापित भएपछि भनेर सोध्नुहोस्। पहिले सुरु भएको उपचारले ढिलाइलाई समर्थन गर्छ। हटाउने दाबीका लागि पछि सुरु भएको उपचार र चयनात्मक मृत्युको तथ्याङ्क चाहिन्छ।
- नियन्त्रण समूहको दोब्बर हुने वक्रमा के भयो भनेर सोध्नुहोस्। सञ्चित दोब्बर हुने चक्रबिना चिह्नकका परिवर्तन सन्दर्भविहीन हुन्छन्।
- एउटा रञ्जन मात्र नभई कम्तीमा दुई प्रकारका चिह्नक माग्नुहोस्, जस्तै कोशिका वृद्धिको सूचकसँगै p16 वा p21 र SA-beta-gal।
- टेलोमियर कसरी रिपोर्ट गरियो भनेर सोध्नुहोस्। समयसँगै प्रत्येक दोब्बर हुने चक्रको दर अर्थपूर्ण हुन्छ। एकपटकको लम्बाइ मापनले त्यो अर्थ दिँदैन।
- के-के स्थिर राखियो भनेर सोध्नुहोस्। नयाँ माध्यममा सार्दा कोशिकाको घनत्व, अक्सिजन, माध्यम परिवर्तन र मिथिलिन ब्लुको ताजा वा पुरानो स्टक घोलले फाइब्रोब्लास्टको विभाजन रोकिने अवस्थालाई बदल्छन्।
यसरी पढ्दा फाइब्रोब्लास्ट साहित्यले मिथिलिन ब्लुलाई सुसंगत तर सीमित भूमिका दिन्छ: कम मात्रामा प्रयोग गरिएको रेडक्स-सक्रिय यौगिक, जसले कल्चरमा हुर्काइएका मानव फाइब्रोब्लास्टमा विभाजनसम्बन्धी जीर्णावस्था ढिलो पार्दै माइटोकन्ड्रियाका मापनमा सुधार ल्याउँछ। यसको क्रियाविधिको सबैभन्दा बलियो विवरण क्षणिक ऊर्जा संकेत र कम्प्लेक्स IV को जैवउत्पत्तिसँग सम्बन्धित छ, तर यी शोधपत्रहरूले जीर्णावस्थामा पुगेका कोशिका हटेको वा मानिसको आयु बढेको देखाएका छैनन्।