लेख
मेथिलिन ब्लु र फेरोप्टोसिस: फलाम, लिपिड पेरोक्सिडेसन र कोषिका मृत्यु
फेरोप्टोसिस भनेको झिल्लीमा क्षति पुगेर हुने कोषिका मृत्यु हो। झिल्लीमा रहेका बहुअसन्तृप्त बोसोहरू शृङ्खलाबद्ध प्रतिक्रियामा अक्सिडाइज हुन्छन्, झिल्लीले काम गर्न छोड्छ र कोषिका मर्छ। यो रासायनिक प्रक्रियाका लागि फलाम आवश्यक हुन्छ। यही वाक्यले सम्पूर्ण अवधारणा समेट्छ, र यस लेखमा भएका सबै कुरा त्यसको कुनै एक भागको परीक्षण हुन्।
यहाँको प्रश्न अझ सीमित छ: कोषिका प्रयोगहरूमा मेथिलिन ब्लुले त्यो शृङ्खलालाई के गर्छ, र त्यस नतिजाले वास्तवमा के देखाउँछ? छोटो उत्तर यो हो कि दुई प्रयोगशाला अध्ययनमा न्यानोमोलर मेथिलिन ब्लुले माइटोकन्ड्रियाको लिपिड पेरोक्सिडेसन घटायो र अन्यथा फेरोप्टोसिस गराउने कारकहरूको प्रयोगपछि पनि कोषिकाहरूलाई जीवित राख्यो। विस्तृत उत्तर अझ महत्त्वपूर्ण छ, किनभने शृङ्खलाको प्रत्येक कडीलाई फरक हस्तक्षेपबाट परीक्षण गरिएको थियो, र प्रत्येक हस्तक्षेपका आफ्नै सीमाहरू छन्।
एक अनुच्छेदमा फेरोप्टोसिस
बहुअसन्तृप्त फ्याटी एसिडको पुच्छर भएको झिल्लीको फस्फोलिपिडमा एउटा कमजोर बिन्दु हुन्छ: सजिलै खोस्न सकिने हाइड्रोजन परमाणुहरू। कुनै रेडिकलले एउटा हाइड्रोजन खोसेपछि लिपिडमा अक्सिजन जोडिन्छ, लिपिड पेरोक्सिल रेडिकल बन्छ, र त्यस रेडिकलले अर्को लिपिडबाट हाइड्रोजन खोस्छ। कुनै कुराले नरोक्दासम्म यो प्रतिक्रिया झिल्लीभरि फैलिन्छ।
यसलाई रोक्ने मुख्य संयन्त्र GPX4 नामक इन्जाइम हो, जसले ग्लुटाथायोन प्रयोग गरेर लिपिड पेरोक्साइडहरूलाई हानिरहित लिपिड अल्कोहलहरूमा रूपान्तरण गर्छ। प्रयोगशालामा प्रयोग हुने कारकहरूले यो प्रतिरक्षाका निश्चित बिन्दुहरूमा आक्रमण गर्छन्। एरास्टिनले सिस्टम xc-माइनस मार्फत हुने सिस्टिनको प्रवेश रोक्छ, जसले कोषिकामा ग्लुटाथायोन संश्लेषणका लागि चाहिने सिस्टिनबाट बन्ने सिस्टिइनको अभाव गराउँछ। बुथियोनिन सल्फोक्सिमिनले ग्लुटाथायोन संश्लेषणलाई सीधै रोक्छ। RSL3 ले GPX4 कै गतिविधि अवरुद्ध गर्छ। यी तीनै कारकले पेरोक्साइडहरू हट्न दिँदैनन्, तर तिनले फरक चरणमा असर गर्छन्। त्यसैले एउटा कारकबाट प्राप्त नतिजा अरूमा स्वतः लागू हुँदैन।
फेरोप्टोसिसलाई परिभाषित गर्ने गुणहरू एपोप्टोसिसका भन्दा फरक हुन्छन्। यसमा क्यास्पेसको क्रमिक सक्रियता हुँदैन र एपोप्टोटिक पिण्डहरू पनि हुँदैनन्। डेफेरोक्सामिनजस्ता फलामलाई बाँध्ने चिलेटर र फेरोस्टाटिन-1 जस्ता रेडिकल समात्ने पदार्थहरूले यसलाई दबाउँछन्। अनुसन्धानकर्ताहरूले कुनै मृत्युलाई केवल नेक्रोटिक नभई फेरोप्टोटिक भन्न यही व्यावहारिक परीक्षण प्रयोग गर्छन्। नियन्त्रित कोषिका मृत्युका मार्गहरूको व्यापक परिप्रेक्ष्यले यो भिन्नता बुझ्न मद्दत गर्छ, र कोषिकाहरूले सजिलै प्रतिक्रियामा भाग लिन सक्ने फलामलाई कसरी व्यवस्थापन गर्छन् भन्ने कुराले चिलेसन किन यति निर्णायक नियन्त्रण परीक्षण हो भन्ने स्पष्ट पार्छ।
माइटोकन्ड्रियाको भूमिका कहाँ पर्छ, र त्यसमा किन विवाद थियो
प्रारम्भिक अध्ययनहरूले माइटोकन्ड्रियाको DNA नभएका कोषिकाहरूमा पनि फेरोप्टोसिस हुन्छ भन्ने देखाएका थिए, जसले माइटोकन्ड्रिया अनिवार्य नभएको सङ्केत दियो। पछिका अध्ययनहरूले माइटोकन्ड्रियाको मात्रा घटाउँदा वा श्वसन रोक्दा सिस्टिइनको अभावबाट हुने फेरोप्टोसिस दबिन सक्छ, तर GPX4 को प्रत्यक्ष अवरोधबाट हुने फेरोप्टोसिस दबिँदैन भन्ने पाए। माइटोकन्ड्रियाको योगदान उत्प्रेरक कारक, कोषिकाको प्रकार र निर्णायक पेरोक्सिडेसन हुने स्थानमा निर्भर हुन्छ भने दुवै नतिजा सही हुन सक्छन्।
यस लेखको आधार बनेको अध्ययनले विशिष्ट कोषिकीय खण्डमा काम गर्ने प्रोब प्रयोग गरेर यो विवादको जाँच गर्यो। MitoCLox लिपिड पेरोक्सिडेसन सूचकको माइटोकन्ड्रिया-लक्षित रूप हो: माइटोकन्ड्रियाभित्र लिपिड पेरोक्सिल रेडिकलहरूसँग भेट हुँदा यसको फ्लोरेसेन्स बदलिन्छ। एरास्टिन प्रयोग गरिएका फाइब्रोब्लास्टहरूमा मृत्यु हुनुअघि नै जीवित कोषिकाहरूमा माइटोकन्ड्रियाको प्रोब अक्सिडाइज भएको देखियो, र कोषिका समूहभरि यसको स्तर एकनास थिएन। त्यो समयक्रम महत्त्वपूर्ण छ। मृत्यु हुनुअघि देखिने पेरोक्सिडेसन सम्भावित कारण हो। मरेका कोषिकामा मात्र मापन गरिएको पेरोक्सिडेसन भने अवशेष हो। लिपिड पेरोक्सिडेसन परीक्षणहरू र प्रत्येक प्रोबले के जनाउँछ भन्ने सहायक मार्गदर्शिकाले प्रोबको स्थानले सङ्केतको अर्थ किन निर्धारण गर्छ भन्ने बताउँछ।
दोस्रो मोडेलमा पनि यही ढाँचा देखियो। लेबर वंशानुगत अप्टिक न्युरोप्याथी भएका एक बिरामीका फाइब्रोब्लास्टहरूमा कम्प्लेक्स I को उत्परिवर्तन र आधारभूत अवस्थामा बढी अक्सिडेटिभ तनाव थियो। ग्लुटाथायोन घटाउँदा यी कोषिकाहरू फेरोप्टोसिसबाट मरे, जबकि नियन्त्रण समूहका फाइब्रोब्लास्टहरूले त्यसको प्रतिरोध गरे। यहाँ पनि माइटोकन्ड्रियाको प्रोबको अक्सिडेसन पहिले नै देखियो। विवरण फेरोप्टोसिसमा माइटोकन्ड्रियाको लिपिड पेरोक्सिडेसनसम्बन्धी फाइब्रोब्लास्ट अध्ययन मा छ।
यी प्रयोगहरूमा मेथिलिन ब्लुले के परिवर्तन गर्यो
मेथिलिन ब्लु एउटा रेडक्स वाहक हो। यसको अक्सिडाइज भएको रूपले कम्प्लेक्स I मा NADH-सँग सम्बन्धित रासायनिक प्रक्रियाबाट इलेक्ट्रोन लिन्छ, र यसको रिड्युस भएको रूपले ती इलेक्ट्रोन साइटोक्रोम c लाई दिन्छ, जसले कम्प्लेक्स IV लाई इलेक्ट्रोन पुर्याउँछ। यसरी शृङ्खलाको त्यो खण्डलाई आंशिक रूपमा छल्ने वैकल्पिक मार्ग बन्छ, जहाँबाट सामान्यतया इलेक्ट्रोन अक्सिजनमा चुहिएर सुपरअक्साइड बन्छ। इलेक्ट्रोन हस्तान्तरणको पूर्ण चित्र बुझ्न चाहने पाठकहरूले मेथिलिन ब्लुले माइटोकन्ड्रियामा इलेक्ट्रोन कसरी सार्छ बाट सुरु गर्नुपर्छ।
एरास्टिन प्रयोग गरिएका फोक्सोका फाइब्रोब्लास्टहरूमा, माइटोकन्ड्रिया-लक्षित एन्टिअक्सिडेन्ट SkQ1 र MitoTEMPO सँगै, 250 nanomolar मेथिलिन ब्लुले पनि कोषिकाको जीवित रहने अवस्था मापन गर्ने परीक्षणमा जीवनक्षमता कायम राख्यो। नियन्त्रण परीक्षणहरूले दाबीको सीमा निर्धारण गर्छन्। फेरोस्टाटिन-1, अल्फा-टोकोफेरोल र डेफेरोक्सामिनले पनि सुरक्षा दिए, जसले मृत्यु फेरोप्टोटिक थियो भन्ने पुष्टि गर्छ। एन्टिअक्सिडेन्ट समूह नभएको SkQ1 को समान संरचनायुक्त पदार्थले सुरक्षा दिएन, जसले गैरविशिष्ट सञ्चयभन्दा रेडक्स रासायनिक प्रक्रिया महत्त्वपूर्ण भएको सङ्केत गर्छ। SkQ1 लगभग 200 nanomolar भन्दा माथि पुग्दा सुरक्षा कमजोर भयो, जुन बढी मात्रामा क्विनोन एन्टिअक्सिडेन्टहरूले अक्सिडेसन बढाउन सक्ने ज्ञात व्यवहारसँग मेल खान्छ। मेथिलिन ब्लुमा पनि सांद्रताअनुसार यस्तै दोहोरो व्यवहार हुन्छ: यी प्रयोगशाला पात्रहरूमा कम न्यानोमोलर स्तरमा यसले सुरक्षा दिन्छ, तर सांद्रता बढाउँदा वा तीव्र प्रकाशमा राख्दा रेडक्स चक्रणबाट हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पन्न गर्न सक्छ। यस प्रकारको मात्रासम्बन्धी सन्दर्भ माइटोकन्ड्रियामा प्रतिक्रियाशील अक्सिजन प्रजातिहरू मा समेटिएको छ।
त्यसपछि अलग गरिएका माइटोकन्ड्रियाका प्रयोगहरूले ROS का स्रोतहरू छुट्याए। फेरस फलाम उपस्थित हुँदा कम्प्लेक्स I लाई इलेक्ट्रोन उपलब्ध गराउने सब्सट्रेटहरू र रोटेनोनले प्रोबको अक्सिडेसन बढाए। रोटेनोनले फ्लेभिन स्थलपछिको मार्ग रोक्छ, त्यसैले त्यसअघिका वाहकहरू रिड्युस अवस्थामा रहन्छन् र म्याट्रिक्सतर्फ फर्किएको फ्लेभिनबाट अक्सिजनमा इलेक्ट्रोन चुहिन्छन्। कम्प्लेक्स III लाई इलेक्ट्रोन उपलब्ध गराउने सब्सट्रेटहरू र एन्टिमाइसिन A ले प्रशस्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड उत्पन्न गरे, तर लिपिड पेरोक्सिडेसन गराएनन्। समग्र ROS सङ्केत उस्तै भए पनि स्थान फरक हुँदा नतिजा फरक भयो। SkQ1 र मेथिलिन ब्लु दुवैले हाइड्रोजन पेरोक्साइडको उत्पादनलाई नदबाई कम्प्लेक्स I बाट प्रेरित पेरोक्सिडेसन दबाए। यसले तिनको कार्य ROS बनेपछि, लिपिड पेरोक्सिडेसनको चरणमा हुने देखाउँछ।
फलामको अत्यधिक भारसम्बन्धी अध्ययन र लिपोफुसिनको सङ्केत
दोस्रो अध्ययनले फलामको पक्षबाट यो प्रश्न जाँच्यो। सबमिलिमोलर फेरिक अमोनियम साइट्रेटको सम्पर्कमा राखिएका H9c2 हृदय-मांसपेशी कोषिकाहरूमा माइटोकन्ड्रियाको ROS, माइटोकन्ड्रियाको लिपिड पेरोक्सिडेसन र त्यसपछि फेरोप्टोसिस देखियो। त्यसपछि 24 hours भित्र लिपोफुसिनजस्तो वर्णक जम्मा भयो। लिपोफुसिन अक्सिडाइज भएका लिपिड र प्रोटिनहरूको फलामयुक्त, आफैँ फ्लोरेसेन्स देखाउने अवशेष हो, जुन उमेरसँगै जम्मा हुँदै जान्छ। यहाँ यसको तीव्र उपस्थितिले फलामबाट प्रेरित तीव्र पेरोक्सिडेसनलाई बुढ्यौलीको एक स्थापित सूचकसँग जोड्छ। न्यानोमोलर मेथिलिन ब्लु र SkQ1 दुवैले पेरोक्सिडेसन, मृत्यु र वर्णकको सञ्चय रोके। अलग गरिएका हृदयका माइटोकन्ड्रियाले पनि यो ढाँचा पुष्टि गरे: रोटेनोन र फेरस फलामले पेरोक्सिडेसन तथा वर्णकजस्तो सङ्केत उत्पन्न गरे, र दुवै पदार्थले त्यसलाई रोके। पूरा क्रम H9c2 हृदय-मांसपेशी कोषिकाहरूमा फलामको अत्यधिक भारसम्बन्धी अध्ययन मा प्रस्तुत गरिएको छ। वर्णकसम्बन्धी पक्ष लिपोफुसिन र कोषिकीय बुढ्यौलीका सूचकहरू सँग सम्बन्धित छ।
कोषिकाको जीवित रहने अवस्था जाँच्ने परीक्षणहरूले के देखाउँदैनन्
CellTiterBlue जस्तो जीवनक्षमता मापन गर्ने परीक्षणले कुनै उत्प्रेरक कारक र सम्भावित सुरक्षात्मक पदार्थ प्रयोग गरेपछि पात्रमा कति कोषिकाहरू चयापचयका दृष्टिले सक्रिय रहन्छन् भन्ने जनाउँछ। यो निश्चित प्रणालीमा कुनै कार्यविधिको परीक्षण हो। यो उपचारको नतिजा होइन। यी कुनै पनि प्रयोगमा बिरामीलाई मात्रा दिइएको थिएन, रोगसम्बन्धी नतिजा मापन गरिएको थिएन वा शरीरमा उपचारका लागि उपयोगी र सुरक्षित मात्राको दायरा स्थापित गरिएको थिएन।
चार सीमाहरू स्पष्ट रूपमा उल्लेख गर्नुपर्छ। पहिलो, कोषिकाका प्रकारहरू सीमित छन्: रूपान्तरित फोक्सोका फाइब्रोब्लास्टहरू, एउटा माइटोकन्ड्रियासम्बन्धी रोग भएको कोषिका लाइनसहितका प्राथमिक छालाका फाइब्रोब्लास्टहरू, मुसाको हृदय-मांसपेशी कोषिकाको एउटा लाइन, र अलग गरिएका मुसाको हृदयका माइटोकन्ड्रिया। संवेदनशीलता कोषिका लाइनअनुसार फरक थियो, र LHON लाइनलाई अध्ययनको बनोटमै असामान्य रूपमा संवेदनशील अवस्थाको प्रतिनिधि बनाइएको थियो। दोस्रो, उत्प्रेरक कारकहरू प्रयोगशालाका चरम अवस्था हुन्: पदार्थको ओसारपसार वा संश्लेषणको पूर्ण अवरोध, र कुनै पनि तन्तुले अचानक सामना नगर्ने स्तरको फलामको भार। तेस्रो, गुणन गरेर सांद्रतालाई मानव मात्रामा बदल्न मिल्दैन। कोषिका संवर्धन माध्यममा न्यानोमोलर सांद्रता मानवलाई दिइने मात्रा होइन। मेथिलिन ब्लुको वितरण, रगत र तन्तुमा यसको रङ्गहीन रूपमा रिड्युसन, प्रकाशको सम्पर्क र झिल्लीको विद्युतीय विभव—यी सबै प्रयोगशाला पात्र र मानिसबीचका भिन्नता हुन्। चौथो, प्रोबहरूले आफ्नै कोषिकीय खण्डको अवस्था जनाउँछन्। MitoCLox को अक्सिडेसनले माइटोकन्ड्रियामा लिपिड रेडिकल बनेको देखाउँछ। यसले सम्भावित अन्तिम घटना मानिने प्लाज्मा झिल्ली फुट्ने प्रक्रिया प्रारम्भिक चरणमै रोकिएर टरेको हो वा सीधै रोकिएको हो भन्ने देखाउँदैन।
त्यसैले यथार्थपरक दाबी यही हो: यी मोडेलहरूमा कम्प्लेक्स I बाट उत्पन्न ROS र फलामले फेरोप्टोसिस हुनुअघि माइटोकन्ड्रियाको लिपिड पेरोक्सिडेसन गराउँछन्, र कम सांद्रतामा मेथिलिन ब्लुले त्यो खण्डलाई रोक्छ। त्यस खण्डभन्दा बाहिरका कुनै पनि निष्कर्षका लागि पहिले जनावरमा र त्यसपछि मानिसमा फरक प्रयोगहरू आवश्यक पर्छन्।