सान्द्रतासँगै मिथिलिन ब्लुको अवशोषण किन बदलिन्छ

मिथिलिन ब्लुको मूल विलयन भएको एउटा बोतल लिनुहोस् र दुईवटा गिलास भर्नुहोस्। पहिलोमा मूल विलयन र दोस्रोमा त्यसलाई दस गुणा पातलो पारिएको विलयन राख्नुहोस्। अपेक्षा गरेअनुसार दोस्रो गिलासको रङ फिका हुन्छ। ध्यान दिएर हेर्दा अर्को कुरा पनि बदलिएको देखिन्छ। रङको छटा सरेको हुन्छ। एउटा विलयन सफा आकाशे निलोतिर र अर्को बैजनी आभा भएको निलोतिर ढल्किन्छ। पातलो पार्दा तीव्रता घट्ने मात्र भएन। अवशोषणको अधिकांश हिस्सा कुन रासायनिक रूपले गर्छ भन्ने पनि बदलियो।

यो परिवर्तनको मूल अवधारणा सरल छ। घुलित मिथिलिन ब्लु एउटै रासायनिक रूपमा मात्र हुँदैन। मोनोमर भनिने एकल रञ्जक धनायन अर्को धनायनसँग आमनेसामने खप्टिएर डाइमर बनाउन सक्छ, र डाइमरहरू मिलेर अझ ठूला समुच्चय बन्न सक्छन्। प्रत्येक रूपको आफ्नै अवशोषण वर्णक्रम हुन्छ। स्पेक्ट्रोफोटोमिटरले देखाउने मान ती अवस्थाहरूमा उक्त क्युभेटमा रहेको मिश्रणका सबै रूपको संयुक्त अवशोषण हो। मिश्रण बदल्दा वर्णक्रम पनि बदलिन्छ, रञ्जकको कुल मात्रा सीधा तनुकरण अनुपातअनुसार घटेको भए पनि।

मोनोमर र डाइमर फरक अवशोषक हुन्

मोनोमरलाई यसको वलय संरचनाभरि धनात्मक आवेश फैलिएको एउटा समतल कार्डका रूपमा कल्पना गर्नुहोस्। यस्ता दुई कार्ड आमनेसामने खप्टिन सक्छन्। धनात्मक आवेशहरूले एकअर्कालाई विकर्षण गर्छन्, तर समतल एरोम्याटिक सतहहरूले खप्टिने अन्तरक्रियामार्फत आकर्षण गर्छन्, र वरपरको पानी तथा प्रतिआयनहरूले विकर्षणको प्रभाव कम गर्छन्। फलस्वरूप साझा इलेक्ट्रोनिक अवस्थाहरू भएको आबद्ध जोडी बन्छ। यसका अनुमत संक्रमणहरू मोनोमरको संक्रमणभन्दा उच्च ऊर्जामा हुन्छन्, त्यसैले डाइमरको ब्यान्ड मोनोमरको ब्यान्डभन्दा छोटो तरङ्गदैर्घ्यमा देखिन्छ। अझ ठूला समुच्चयहरूले निलोतर्फ थप काँधजस्तो उभारमा योगदान गर्छन्।

स्वच्छ पानीमा अत्यन्त न्यून सान्द्रता हुँदा मोनोमरहरू प्रमुख हुन्छन् र लामो तरङ्गदैर्घ्यको ब्यान्ड हावी हुन्छ। कुल सान्द्रता बढ्दा जोडी बनेको रूपको हिस्सा बढ्दै जान्छ र पहिलो ब्यान्डको तुलनामा छोटो तरङ्गदैर्घ्यको ब्यान्ड बढ्छ। त्यसैले दुई ब्यान्डको अनुपातले सीधै कुल सान्द्रता होइन, मिश्रणको सङ्घटन जनाउँछ। कुन रूप उपस्थित छ भन्ने मान्यता नलिई एउटै तरङ्गदैर्घ्यको मापनबाट यी दुईलाई छुट्याउन सकिँदैन।

यसैले सन्दर्भ वर्णक्रमसँग सधैँ त्यसका अवस्थाहरू पनि हुनुपर्छ। मिथिलिन ब्लुको वर्णक्रमीय सन्दर्भ ले ब्यान्डका स्थानसँगै ती प्राप्त गर्न प्रयोग गरिएको विलायक, पृष्ठभूमि लवण, pH, तापक्रम र सान्द्रताको दायरा तालिकामा दिन्छ। ती अवस्थाबिना कुनै शिखरको मान उद्धृत गर्दा उक्त संख्या पर्याप्त रूपमा परिभाषित हुँदैन। एउटै रञ्जकबाट फरक वर्णक्रमबारे दुई प्रयोगशाला दुवै सही हुन सक्छन्, किनभने तिनले फरक मिश्रण मापन गरेका हुन्छन्।

सन्तुलनलाई के कुराले सार्छ

सान्द्रता मुख्य कारक हो। डाइमर बन्न दुई मोनोमर भेटिनुपर्छ, त्यसैले कुल रञ्जक बढ्दा डाइमरको हिस्सा रैखिक दरभन्दा छिटो बढ्छ। कोठाको तापक्रमनजिक पानीमा मापन गरिएका डाइमरीकरण स्थिराङ्कहरू प्रति molar हजारौँको क्रममा हुन्छन्, त्यसैले micromolar दायरामा डाइमरको हिस्सा तीव्र रूपमा बढ्छ। micromolar देखि millimolar सम्मको रञ्जक दायरा समेटिएको व्यापक समग्र फिटमा 34 micromolar भन्दा तलै टेट्रामरको योगदान शून्यभन्दा बढी भेटियो। यसले दसौँ micromolar को सान्द्रतामा कडाइका साथ दुई रूप मात्र मानिएको फिटमा भर पर्न नहुने चेतावनी दिन्छ। ठ्याक्कै कति अंश हुन्छ भन्ने कुरा माध्यममा निर्भर हुन्छ, त्यसैले यस लेखले सार्वभौमिक रूपान्तरण तालिकाको सट्टा परिवर्तनका दिशाहरू दिन्छ।

लवण दोस्रो कारक हो। घुलित आयनहरूले दुई धनायनबीचको विकर्षणको प्रभाव कम गर्छन्, त्यसैले सोडियम क्लोराइड र यस्तै विद्युत् अपघट्य थप्दा उही रञ्जक सान्द्रतामा मिश्रण डाइमर र समुच्चयतर्फ सर्छ। यो प्रभाव लवणीय र जलीय माध्यममा मिथिलिन ब्लुको समुच्चयनसम्बन्धी अध्ययनहरू मा देखिन्छ, जहाँ लगभग 1 micromolar देखि 3.4 millimolar सम्मको रञ्जकलाई 0 देखि 0.15 molar सोडियम क्लोराइडको दायरामा मापन गरिएको थियो। उक्त फिटमा उच्च रञ्जक र उच्च लवण भएको छेउमा टेट्रामरको अंश लगभग 0.93 पुगेको थियो। त्यसैले पानीमा रेकर्ड गरिएको वर्णक्रम र शारीरिक लवणीय विलयनमा रेकर्ड गरिएको वर्णक्रमलाई एकअर्काको सट्टा प्रयोग गर्न मिल्ने मानक मान्न सकिँदैन।

तापक्रमले विपरीत दिशामा तान्छ। खप्टिँदा आबद्ध पानी मुक्त हुन्छ, र तापीय गतिले खप्टिने प्रक्रियाको विरोध गर्छ। त्यसैले विलयन तताउँदा सामान्यतया केही डाइमर छुट्टिएर फेरि मोनोमर बन्छन्, जबकि चिस्याउँदा जोडिने प्रक्रिया अनुकूल हुन्छ। फिटबाट प्राप्त वियोजन एन्थाल्पी ऋणात्मक छ, 282 देखि 333 kelvin को दायरामा लगभग माइनस 30 kilojoules per mole, जसले ऊष्मा उत्सर्जन गर्ने संयोजन पुष्टि गर्छ। फ्रिजबाट निकालेपछि तुरुन्त मापन गरिएको चिसो नमुना, कोठाको तापक्रमसँग सन्तुलनमा पुगेपछि मापन गरिएको त्यही नमुनाभन्दा बढी समुच्चयित देखिन सक्छ।

विलायकले आधारभूत अवस्था तय गर्छ। पानीको बलियो जलविमुख प्रभावले समतल रञ्जक धनायनहरूलाई खप्टिन प्रोत्साहन गर्छ। इथानोल र मिथानोलजस्ता अल्कोहलहरूले वलयहरूलाई अझ राम्रोसँग विलायक अणुहरूले घेर्छन् र समुच्चयहरू तोड्छन्। त्यसैले उही रञ्जक सान्द्रता पानीभन्दा इथानोलमा बढी मोनोमरयुक्त देखिन्छ। एप्रोटिक सहविलायकहरूले पनि यही गर्छन्: 293 kelvin मा पानी र DMSO का मिश्रणहरूमा थपिएको DMSO ले डाइमरीकरण दबायो, जसले पानीको संरचनालाई खप्टिने प्रक्रियाको प्रेरकका रूपमा सङ्केत गर्छ। पृष्ठसक्रिय पदार्थका हकमा दुवै दिशातर्फ सावधानी चाहिन्छ। तिनको क्रान्तिक माइसेल सान्द्रताभन्दा माथि, माइसेलहरूले मोनोमरलाई छुट्टाछुट्टै घुलनशील बनाएर मोनोमरजस्तो वर्णक्रम पुनःस्थापित गर्न सक्छन्। त्यस बिन्दुभन्दा तल भने विपरीत आवेश भएको पृष्ठसक्रिय पदार्थले खप्टिने प्रक्रिया बढाउन सक्छ: 100 micromolar रञ्जकमा, SDS द्वारा प्रेरित बहुलकीकरण लगभग 4 millimolar SDS मा, अर्थात् माइसेल बन्ने बिन्दुको करिब आधामा, उच्चतम भयो र त्यसपछि पृष्ठसक्रिय पदार्थको मात्रा बढ्दा पुनर्वितरण भयो। मिथिलिन ब्लुको वर्णक्रममा रञ्जक-विलायक र व्यवस्थित माध्यमका प्रभावहरू सम्बन्धी कामले समग्र सान्द्रता मात्र होइन, अणुको तत्काल वरपरको वातावरणले पनि देखिने ब्यान्डहरूलाई कति बलियोसँग निर्धारण गर्छ भन्ने देखाउँछ।

pH को प्रभाव मुख्यतः चरम अवस्थाहरूमा महत्त्वपूर्ण हुन्छ। अधिकांश प्रयोगशाला काममा प्रयोग हुने तटस्थनजिकको दायरामा मिथिलिन ब्लु आफ्नो परिचित धनायनिक निलो रूपमा रहन्छ, र वर्णक्रममा हुने परिवर्तनमा समुच्चयन हावी हुन्छ। प्रबल अम्ल वा क्षार, रङहीन ल्युको रूप उत्पन्न गर्ने रेडक्स रसायन, वा प्रोटिन तथा कणहरूसँगको बन्धनले मोनोमर-डाइमर जोडीभन्दा बाहिरका अवस्थाहरू थप्छन्। बफर थपेपछि वर्णक्रम बदलिँदा सबै कुरा pH लाई मात्र जिम्मेवार ठहर्‍याउनुअघि बफरको संरचनामा लवण र बन्धन बनाउन सक्ने घटकहरू जाँच्नुहोस्। रसायन तथा प्रोटोनीकरणसम्बन्धी सन्दर्भले यी पहिचानका प्रश्नहरूलाई यहाँ चर्चा गरिएको समुच्चयनको प्रश्नबाट अलग राख्छ।

बियर-ल्याम्बर्टको सीधा रेखा किन मोडिन्छ

बियर-ल्याम्बर्ट सम्बन्धले अवशोषणमान अवशोषकता, सान्द्रता र प्रकाशीय पथको लम्बाइको गुणनफल बराबर हुन्छ भन्छ। यो गणनाको नियम हो। यसले गनिएका वस्तुहरूको संख्या बदलिँदा पनि तिनीहरू उस्तै रहन्छन् भन्ने मान्छ: एउटै अवशोषक रूप, स्थिर वर्णक्रम, सान्द्रतासँगै कुनै रासायनिक परिवर्तन नहुने, जाँचका लागि एकवर्णी प्रकाश, प्रकीर्णन वा पुनःउत्सर्जन नहुने, र प्रकाशले वास्तवमै उल्लेखित पथ पार गर्ने।

समुच्चयनले पहिलो मान्यता तोड्छ। औपचारिक रूपमा कुल अवशोषणमान सबै रूपको योगदानको योग नै रहन्छ: प्रकाशीय पथको लम्बाइलाई प्रत्येक रूपको अवशोषकता र त्यसै रूपको सान्द्रताले गुणन गरिएको मानहरूको योग। प्रत्येक रूपले नियम पालना गर्छ। मिश्रणले गर्दैन, किनभने प्रत्येक रूपको सान्द्रता कुल रञ्जकको अरैखिक फलन हुन्छ। त्यसैले कुल रञ्जकको सापेक्ष मोनोमर ब्यान्डको अवशोषणमानको अंशाङ्कन वक्र अत्यन्त पातलो अवस्थामा सीधा सुरु हुन्छ र सान्द्रता बढ्दै जाँदा तलतिर मोडिन्छ, किनभने प्रत्येक थपिएको मात्राले अनुपातका हिसाबले कम मोनोमर ल्याउँछ। डाइमर ब्यान्डमा मापन गरिएको वक्र अर्कोतर्फ मोडिन्छ। समुच्चयनसम्बन्धी कामले देखिएका ल्याम्बर्ट-बियर विचलनको स्रोतका रूपमा यही प्रक्रियालाई औँल्याउँछ। मोडिएको क्षेत्रमा सीधा रेखा फिट गरेर त्यसलाई बाहिरसम्म विस्तार गर्नु सामान्य त्रुटि हो। उक्त रेखा जुन दायरा र माध्यममा बनाइएको हो, त्यसभित्र मात्र मान्य हुन्छ।

पातलो पार्दा यससँग सम्बन्धित अर्को भ्रम सिर्जना हुन्छ। उपकरणको मापन दायराभित्र ल्याउन सान्द्र मूल विलयनलाई पातलो पार्दा विभिन्न रूपको अनुपात जस्ताको तस्तै रहँदैन। क्युभेटमा रहेको पातलो विलयन पुनःसन्तुलित भएर मोनोमरतर्फ सर्छ, त्यसैले यसको वर्णक्रमले पातलो नमुनालाई सही रूपमा वर्णन गर्छ तर मूल विलयनलाई गलत रूपमा वर्णन गर्छ। अवशोषणमानलाई बढाएर मूल विलयनको वर्णक्रमको उल्टो गणना गर्दा कुल मात्राको अनुमान त्यस अवस्थामा मात्र पुनःप्राप्त हुन्छ, जब अंशाङ्कनले यो परिवर्तनलाई पहिले नै समेटेको हुन्छ। यसले मूल ब्यान्डको आकार कहिल्यै पुनःस्थापित गर्दैन। सान्द्र विलयनको वर्णक्रमलाई पातलो सन्दर्भसँग तुलना गर्ने जोकोहीले दुई फरक मिश्रण तुलना गरिरहेको हुन्छ।

प्रकाशीय पथको लम्बाइ नतिजाको हिस्सा हो

अवशोषणमान नमुनाभित्र प्रकाशले पार गर्ने दूरीसँग समानुपातिक हुन्छ। उही विलयन भएको 10 mm क्युभेटले 1 mm क्युभेटको दस गुणा अवशोषणमान दिन्छ। यो अनुपात उही विलयनका लागि मात्र ठ्याक्कै मिल्छ, र समुच्चयनका कारण यो सर्त निर्णायक हुन्छ।

व्यवहारमा, प्रकाशीय पथको लम्बाइ मान्य दायराभित्र रहन प्रयोग गरिने साधन हो। लामो पथले पातला, मुख्यतः मोनोमरयुक्त विलयनहरूमा संवेदनशीलता दिन्छ। छोटो पथले सन्तुलन फेरि बदल्ने ठूलो तनुकरण नगरी सान्द्र नमुनालाई उपकरणको मापन दायराभित्र राख्छ। माथिका संख्याहरूको आधार बनेको समुच्चयन अध्ययनले ठ्याक्कै यही अभ्यास गरेको थियो: 1.1 देखि 34 micromolar रञ्जकका लागि 1 centimeter सेलहरू, र 94 micromolar देखि 3.4 millimolar का लागि 0.01 centimeter सेलहरू। सूक्ष्म-आयतन मापनका आधारपीठ र प्लेट रिडरहरूमा आफ्नै ज्यामिति हुन्छ, जसमा छोटा र कहिलेकाहीँ परिवर्तनशील पथहरू तथा धनायनिक रञ्जक अधिशोषित हुन सक्ने सतहहरू हुन्छन्। वर्णक्रमीय सन्दर्भले विलायक र लवण उल्लेख गरेजस्तै संख्यासँगै पथ पनि उल्लेख गर्नुहोस्। प्रकाशीय पथको लम्बाइबिनाको अवशोषणमान नतिजा होइन। त्यो हल्ला हो।

मापनको अनुशासन यही प्रक्रियाबाट निस्कन्छ। मापन गर्नुअघि नमुनाहरूलाई एउटै तापक्रममा सन्तुलित हुन दिनुहोस्। एउटै प्रकार र अभिमुखीकरणका क्युभेट, उही लवण र बफर पृष्ठभूमि भएका मिल्दो ब्ल्याङ्क, र सफा काँचका भाँडा प्रयोग गर्नुहोस्, किनभने मिथिलिन ब्लु काँच र प्लास्टिकमा अधिशोषित हुन्छ र रङ लागेको क्युभेटले अघिल्लो सान्द्र नमुनाको छाप बोक्छ। समुच्चयनको गतिविज्ञान महत्त्वपूर्ण हुँदा नमुना तयार गरेपछि तुरुन्त मापन गर्नुहोस्, र प्रत्येक अंशाङ्कन वक्र अज्ञात नमुनाकै माध्यममा र उही प्रकाशीय पथको लम्बाइमा बनाउनुहोस्। दृश्य जाँचका लागि आँखा कमजोर वर्णक्रममापक हो भन्ने सम्झनुहोस्। विलयनको रङले शुद्धता स्थापित गर्न सक्छ कि सक्दैन भन्ने छुट्टै प्रश्न हो, जसको उत्तर नकारात्मक छ, र समुच्चयनबाट हुने रङको छटा परिवर्तन त्यसको एउटा कारण हो।

उपकरणको छेउमा राख्न मिल्ने चित्र

तलको चित्रले यस लेखलाई प्रयोगशाला कार्यमेजमा राख्न मिल्ने एउटै सन्दर्भमा सङ्क्षेप गर्छ। तीनवटा विलयनमा एउटै रञ्जक छ, तर कुल सान्द्रता र पृष्ठभूमि लवण फरक छन्। तिनका योजनात्मक वर्णक्रमहरूले खप्टिने क्रम बढ्दै जाँदा लामो तरङ्गदैर्घ्यको मोनोमर ब्यान्डको हिस्सा छोटो तरङ्गदैर्घ्यको डाइमर ब्यान्डतर्फ गएको देखाउँछन्। चित्रमा अवस्थाहरू छापिएका छन्, किनभने तिनबिना वक्रहरू पुनःप्रयोग गर्न सकिँदैन। उल्लेखित अवस्थाहरूमा मापन गरिएका ब्यान्डका स्थानका लागि वर्णक्रमीय सन्दर्भ प्रयोग गर्नुहोस्। विलयनमा आएपछि रञ्जक कोषिकाभित्र कसरी पस्छ भन्ने जान्न अपचयन र विभाजनमार्फत कोषिकामा प्रवेश हेर्नुहोस्। प्रकाशको मात्रा र ज्यामितिले प्रकाशरासायनिक मापन नतिजालाई थप कसरी आकार दिन्छन् भन्ने जान्न प्रकाश सम्पर्क र मापनको ज्यामिति हेर्नुहोस्।

सम्झेर लैजानुपर्ने नियमका दुई भाग छन्। वर्णक्रमले उल्लेखित अवस्थाहरूमा क्युभेटमा रहेको मिश्रण पहिचान गर्छ। ठ्याक्कै तिनै अवस्थाहरूमा बनाइएको अंशाङ्कनले मात्र अवशोषणमानलाई कुल सान्द्रतामा रूपान्तरण गर्छ।