के मेथिलिन ब्लुले माइटोकन्ड्रियाको कम्प्लेक्स III लाई बाइपास गर्न सक्छ? अध्ययनहरू किन असहमत छन्

दुई प्रयोगशालाले मेथिलिन ब्लुले अवरुद्ध माइटोकन्ड्रियल कम्प्लेक्स III लाई बाइपास गर्न सक्छ कि सक्दैन भन्ने प्रश्न सोधे। एउटाले सक्दैन भन्यो। अर्कोले सक्छ भन्यो। दुवैसँग तथ्याङ्क थिए।

मुसाको मस्तिष्कका माइटोकन्ड्रियामा गरिएको पहिलो अध्ययनले यो रङले त्यसो गर्न नसक्ने पत्ता लगायो। तीन कृन्तक प्रजातिका मस्तिष्कका माइटोकन्ड्रियामा गरिएको दोस्रो अध्ययनले आंशिक रूपमा सक्ने पत्ता लगायो। मुसाको कलेजोमा गरिएको तेस्रो अध्ययनलाई पनि प्रायः यही सन्दर्भमा उद्धृत गरिन्छ, तर त्यसले अर्कै कुरा परीक्षण गरेको थियो। त्यसलाई उचित सन्दर्भमा राख्दा आधा अन्योल हट्छ।

यहाँ सबै अवस्थामा लागू हुने कुनै कार्यविधि घोषणा गर्न मिल्दैन। फरक अवरोधक, मात्रा र मापन भएका तीन प्रयोग छन्। पहिले प्रयोगका अवस्थाहरू पढ्नुहोस्। निष्कर्ष त्यसपछि आउँछन्।

यहाँ बाइपासको अर्थ के हो

इलेक्ट्रोनहरू कम्प्लेक्स I हुँदै (NADH बाट) वा कम्प्लेक्स II हुँदै (सक्सिनेटबाट) शृङ्खलामा प्रवेश गर्छन्, कम्प्लेक्स III हुँदै साइटोक्रोम c मा पुग्छन्, अनि कम्प्लेक्स IV हुँदै अक्सिजनमा पुग्छन्। यस क्रममा बनेको प्रवणतालाई कोषले ATP बनाउन प्रयोग गर्छ।

बाइपासको दाबीअनुसार मेथिलिन ब्लुले अवरोधभन्दा अघिल्लो भागबाट इलेक्ट्रोन लिन्छ र अवरोधभन्दा पछिल्लो भागमा पुर्‍याउँछ। अक्सीकृत रङले NADH वा शृङ्खलाका प्रारम्भिक घटकबाट इलेक्ट्रोन लिएर ल्युकोमेथिलिन ब्लु बन्छ, र यो अपचयित रूपले ती इलेक्ट्रोन साइटोक्रोम c लाई दिन्छ वा फेरि शृङ्खलामा पठाउँछ। इलेक्ट्रोन हस्तान्तरण अवरोधभन्दा पछिल्लो भागमा भयो भने श्वसन र झिल्ली विभव आंशिक रूपमा पुनःस्थापित हुन्छन्। हस्तान्तरण अवरोध भएको ठाउँमै वा त्यसभन्दा अघिल्लो भागमा भयो भने कुनै पुनःस्थापना हुँदैन।

कम्प्लेक्स III को एउटा विशेषताले यो विवादको धेरै हिस्सा निर्धारण गर्छ। यस कम्प्लेक्सले दुई अवरोधक-बन्धन स्थल भएको Q चक्र सञ्चालन गर्छ। एन्टिमाइसिन Qi स्थलमा बाँधिन्छ। मिक्सोथियाजोल Qo स्थलमा बाँधिन्छ। यीमध्ये एउटा मात्र प्रयोग गर्ने अध्ययनले कम्प्लेक्सको आधा भाग मात्र परीक्षण गरेको हुन्छ।

पहिलो अध्ययन: मुसाको मस्तिष्कका माइटोकन्ड्रियामा बाइपास भएन

Gureev र सहकर्मीहरूले C57BL/6 मुसाको मस्तिष्कको कर्टेक्सबाट डिजिटोनिनद्वारा अलग गरिएका माइटोकन्ड्रिया प्रयोग गरे र प्रति ml 0.1 mg प्रोटिनको सांद्रतामा परीक्षण गरे। सब्स्ट्रेटका तीन अवस्था थिए: पाइरुभेट र म्यालेट प्रत्येक 5 mM, सक्सिनेट 10 mM सँग ग्लुटामेट 2 mM, र L-प्रोलिन 10 mM। अवरोधकहरू रोटेनोन 1 micromolar (कम्प्लेक्स I) र एन्टिमाइसिन प्रति ml 1 microgram (कम्प्लेक्स III) थिए। रङका मात्राहरू 0.5, 1 र 2 micromolar थिए, जसमा मुख्य सांद्रता 1 micromolar थियो। विधि र मापनका ट्रेसहरू FEBS Letters को संक्षिप्त शोधपत्र मा छन्।

कम्प्लेक्स I को बाइपास सफल भयो। रोटेनोनले ADP-द्वारा उत्तेजित श्वसनलाई करिब 121 बाट करिब 2 nmol प्रति मिनेट प्रति mg मा घटायो, र 1 micromolar रङले त्यसलाई करिब 21 मा पुनःस्थापित गर्‍यो। पाइरुभेट र म्यालेटमा तथा L-प्रोलिनमा झिल्ली विभव पुनःस्थापित भयो।

कम्प्लेक्स III को बाइपास भएन। एन्टिमाइसिनले श्वसनलाई करिब 16 मा घटायो, र रङले त्यसलाई करिब 20 सम्म मात्र पुर्‍यायो। रङको मात्रा 5 micromolar सम्म हुँदा पनि कुनै सब्स्ट्रेटमा झिल्ली विभव पुनःस्थापित भएन। पेरोक्साइडका तथ्याङ्कले पनि यही सङ्केत दिए: रङ मात्र प्रयोग गर्दा पेरोक्साइड उत्सर्जनको आधार दर करिब 76 pmol प्रति मिनेट प्रति mg बाट तीन मात्रामा क्रमशः लगभग 1170, 1460 र 1945 पुग्यो, तर एन्टिमाइसिनले रङद्वारा उत्पन्न त्यो सङ्केतलाई क्रमशः करिब 25, 88 र 96 प्रतिशत घटायो। अपचयित रङले अक्सिजनसँग सीधै प्रतिक्रिया गरेको भए कम्प्लेक्स III अवरुद्ध गर्दा सङ्केत दबिनु हुँदैनथ्यो। लेखकहरूले अपचयित रङ एन्टिमाइसिनको अवरोधभन्दा अघिल्लो भागमा रहेको कम्प्लेक्स III को Qo स्थलमा अक्सीकृत हुन्छ भन्ने निष्कर्ष निकाले। शब्दमा भन्दा, छोटो चक्र यस्तो छ: दाताबाट रङमा, रङबाट Qo मा, अनि अगाडि सामान्य मार्गबाट। रोटेनोनको अवरोध बाइपास हुन्छ। एन्टिमाइसिनको हुँदैन।

दोस्रो अध्ययन: तीन प्रजातिमा, दुवै अवरोधक स्थलमा आंशिक बाइपास

Svab र सहकर्मीहरूले प्रयोगको दायरा फराकिलो बनाए। मुसा, र्‍याट र गिनी पिगको मस्तिष्कबाट Percoll प्रयोग गरी अलग गरिएका माइटोकन्ड्रियालाई उही प्रति ml 0.1 mg सांद्रतामा परीक्षण गरियो। सब्स्ट्रेट पाइरुभेट र म्यालेट वा ग्लुटामेट र म्यालेट थिए, प्रत्येक 5 mM मा। उनीहरूले कम्प्लेक्स III का दुई अवरोधक प्रयोग गरे: एन्टिमाइसिन A 0.3 micromolar र मिक्सोथियाजोल 1 micromolar। अधिकांश परीक्षणमा रङ 2 micromolar थियो, साइटोक्रोम c सम्बन्धी परीक्षणमा 0.5 थियो। मिल्दो प्रोटोकल प्रयोग गरिएका तीनै प्रजातिका विवरण खुला पहुँच भएको शोधपत्र मा छन्।

तीनै प्रजातिमा दुवै अवरोध आंशिक रूपमा बाइपास भए। मुसाका माइटोकन्ड्रियामा एन्टिमाइसिनले श्वसन दबायो र रङले त्यसलाई लगभग 37 बाट 59 nmol प्रति मिनेट प्रति mg सम्म, करिब 60 प्रतिशत बढायो। मिक्सोथियाजोलले त्यसलाई 88 प्रतिशत घटाएर करिब 4.5 मा झार्‍यो, र रङले पाँच गुणा बढाएर करिब 23 मा पुर्‍यायो। दुवैमध्ये जुनसुकै अवरोधक हुँदा पनि झिल्ली विभव आंशिक रूपमा पुनःध्रुवीकृत भयो। प्रकाशीय मापनजन्य त्रुटि नहोस् भनेर यसलाई दुई रङ (साफ्रानिन O र अनुपातमितीय TMRM) बाट मापन गरियो।

यस शोधपत्रले इलेक्ट्रोन हस्तान्तरणको प्रत्यक्ष परीक्षण पनि गर्‍यो, जुन पहिलो अध्ययनले गरेको थिएन। बाहिरबाट थपिएको 25 micromolar एसिटिलीकृत साइटोक्रोम c लाई ऊर्जित माइटोकन्ड्रियाले अवरोधक भए पनि नभए पनि अपचयित गरेनन्, तर रङ थप्दा दुवै अवस्थामा अपचयन भयो। कोषरहित बफरमा NADH र रङले साइटोक्रोम c लाई NADH को सांद्रतासँग समानुपातिक दरमा अपचयित गरे। शब्दमा भन्दा, लामो छलाङ यस्तो छ: अपचायक समतुल्यबाट रङमा, रङबाट सीधै साइटोक्रोम c मा, कम्प्लेक्स IV हुँदै अक्सिजनमा। यो मार्गले कम्प्लेक्स III लाई पूरै छोड्छ, त्यसैले दुवै अवरोधकको अवरोध बाइपास गर्न सकिन्छ।

थप दुई मापनले यो व्याख्यालाई समर्थन गर्छन्। मिक्सोथियाजोलद्वारा उपचार गरिएका माइटोकन्ड्रियामा रङ थप्दा NAD(P)H को प्रतिदीप्ति घट्यो, अर्थात् अपचायक समतुल्यहरू नयाँ मार्गबाट बाहिरिए। साथै, 660 nm मा रङको अवशोषणले क्रमशः गरिएका प्रत्येक थपाइलाई पछ्यायो। सेन्ट्रिफ्युज गरेर प्राप्त माथिल्लो तरलले ऊर्जित माइटोकन्ड्रियाभित्र अक्सीकृत रङ सय गुणाभन्दा बढी सघन भएको र विभव ढलेपछि बाहिर निस्किएको देखायो। प्रोटोनको हिसाब पनि मिल्छ: पम्पिङका चरणहरू छोड्दा प्रति इलेक्ट्रोन जोडी 10 को सट्टा लगभग 2 प्रोटोन मात्र रहन्छन्। त्यसैले अक्सिजनको प्रयोग छिटो भए पनि पुनःध्रुवीकरण आंशिक मात्र हुनु वास्तविक बाइपासको अपेक्षित स्वरूप हो, त्यसविरुद्धको प्रमाण होइन।

यही तयारीमा देखिएका केही प्रतिक्रियाहरूले सतही पढाइलाई गलत निष्कर्षमा पुर्‍याउन सक्छन्। अवरोधक र रङ सँगै हुँदा ADP ले श्वसन बढाउनुको सट्टा घटायो, र परिवहन अवरुद्ध गर्दा श्वसन सुस्त हुनुको सट्टा बढ्यो। तर झिल्ली विभव भने सामान्य दिशामै बदलियो। यस प्रणालीमा अक्सिजन खपत मात्र हेर्दा भ्रम हुन्छ।

तेस्रो अध्ययन: कम्प्लेक्स III होइन, I र II परीक्षण गर्ने कलेजोको अध्ययन

Lee र Boelsterli ले मुसाको कलेजोका माइटोकन्ड्रिया र संवर्धित कलेजो कोषहरू प्रयोग गरे, जसमा एफाभिरेन्ज (कम्प्लेक्स I, IC50 करिब 30 micromolar) र आइसोनियाजिडको मेटाबोलाइट हाइड्राजिन (कम्प्लेक्स II, IC50 करिब 30 micromolar) ले क्षति पुर्‍याएका थिए। करिब 30 micromolar रङले अक्सिकारकहरू र नेक्रोटिक मृत्यु घटाउँदै NADH अक्सीकरण, झिल्ली विभव र ATP पुनःस्थापित गर्‍यो। Redox Biology को शोधपत्र ले यसलाई रङले क्षतिग्रस्त कम्प्लेक्स I र II लाई छलेर इलेक्ट्रोन बोक्ने प्रक्रियाका रूपमा प्रस्तुत गर्छ।

यो परिणाम शृङ्खलाको अघिल्लो भागसँग सम्बन्धित स्थापित सन्दर्भ हो। यसले कम्प्लेक्स III बारे केही भन्दैन, किनभने त्यस अध्ययनमा उक्त कम्प्लेक्स अवरुद्ध नै गरिएको थिएन। यसले मस्तिष्कसम्बन्धी कुनै पनि अध्ययनलाई पुष्टि वा खण्डन गर्न सक्दैन।

प्रयोगका अवस्थाहरूको तुलना तालिका

कम्प्लेक्स III का दुवै अध्ययन आफ्नै प्रयोगका अवस्थाबारे सही हुन सक्ने चार कारण

1. अवरोधकको प्रयोग एउटै हस्तक्षेप थिएन। एकातिर प्रति ml 1 microgram एन्टिमाइसिन मात्र थियो, अर्कोतिर 0.3 micromolar एन्टिमाइसिन र छुट्टै Qo स्थल अवरोधक थियो। Qo स्थलमा इलेक्ट्रोन पुर्‍याउने रङको मार्ग त्यही ठाउँमा असफल हुन्छ जहाँ सीधै साइटोक्रोम c मा जाने मार्ग सफल हुन्छ। एउटा स्थलले दुवैको प्रतिनिधित्व गर्न सक्दैन।

2. रङको मात्रा र समय फरक थिए। मुख्य सांद्रता 1 र 2 micromolar थिए। रेडक्स चक्रमा भाग लिने यस पदार्थको प्रवेश र यसले गर्ने साइटोक्रोम c को प्रत्यक्ष अपचयन सांद्रता र समयमा निर्भर हुन्छन्। मात्राको सानो अन्तर र मापनको फरक समयले एउटै सञ्जालका फरक मार्गहरू देखाउन सक्छन्।

3. तयारीहरू फरक थिए। डिजिटोनिनद्वारा अलग गर्ने विधि र Percoll ग्रेडियन्टद्वारा अलग गर्ने विधिले केही हदसम्म उस्तै तर पूर्ण रूपमा समान नभएका माइटोकन्ड्रिया समूहहरू चयन गर्छन्। प्रोटिन सांद्रता दुवैमा प्रति ml 0.1 mg भएकाले त्यो कारक हट्छ, तर उपसमूह र संरचनागत अखण्डता हट्दैनन्। प्रजातिको भिन्नता कारण हुन सक्ने शङ्का पनि हट्यो: दोस्रो समूहले मुसामा समेत उही विशेष प्रतिक्रिया पुनःउत्पादन गर्‍यो।

4. सब्स्ट्रेटको अवस्थाले रङले के गर्न सक्छ भन्ने निर्धारण गर्छ। एकातिर सब्स्ट्रेटका तीन अवस्था थिए, अर्कोतिर NADH सँग सम्बन्धित जोडीहरू। NADH को आपूर्ति र झिल्ली विभवले संयुक्त रूपमा रङ कति छिटो अपचयित हुन्छ र कहाँ बाँडिन्छ भन्ने निर्धारण गर्छन्। अक्सीकृत साइटोक्रोम c नजिक अपचयित रङ चाहिने मार्ग त्यही छनोटमा निर्भर हुन्छ।

बाइपासको अर्को दाबी कसरी पढ्ने

कुन कम्प्लेक्सलाई, कुन अवरोधकले, कुन स्थलमा र कति मात्रामा अवरुद्ध गरिएको थियो भनेर सोध्नुहोस्। रङको सांद्रता कति थियो र मापन कहिले लिइएको थियो भनेर सोध्नुहोस्। तन्तु, प्रजाति, अलग गर्ने विधि, प्रोटिन सांद्रता र सब्स्ट्रेटबारे सोध्नुहोस्। अनि विभव, श्वसन, रेडक्स अवस्था र प्रत्यक्ष हस्तान्तरण परीक्षणले एकअर्कासँग मेल खाने नतिजा दिएका छन् कि छैनन् भनेर सोध्नुहोस्, किनभने यहाँ अक्सिजन खपतले मात्र एकभन्दा बढी पटक गलत सङ्केत दिएको थियो।

सीमित निष्कर्ष कायम रहन्छ। रङले कम्प्लेक्स I लाई बाइपास गर्ने कुरामा सहमति छ। कम्प्लेक्स III को हकमा, प्रति ml 1 microgram एन्टिमाइसिन र 1 micromolar रङ प्रयोग गरिएका मुसाका माइटोकन्ड्रियामा कार्यात्मक बाइपास देखिँदैन। तर 0.3 micromolar एन्टिमाइसिन वा 1 micromolar मिक्सोथियाजोल र 2 micromolar रङ प्रयोग गरिएका तीन प्रजातिमा रङबाट साइटोक्रोम c मा प्रत्यक्ष इलेक्ट्रोन हस्तान्तरणसहित आंशिक बाइपास देखिन्छ। यी निष्कर्षहरू एकैसाथ सही हुन सक्छन्। यसभन्दा व्यापक कुनै निष्कर्ष प्रमाणको सीमाभन्दा बाहिरको विस्तार हो।

सम्बन्धित पठनले विवादित दाबीलाई निर्विवाद रसायनशास्त्रको सीमाभित्र राख्छ: इलेक्ट्रोन हस्तान्तरण शृङ्खलाका लागि मेथिलिन ब्लुले इलेक्ट्रोन कसरी सार्छ, शृङ्खलाको अघिल्लो भागमा स्थापित बाइपासका लागि कम्प्लेक्स I बाइपासका प्रयोगहरू, दुई रङ किन आवश्यक थिए भन्ने बुझ्न झिल्ली विभवका मापन र तिनका मापनजन्य त्रुटिहरू, र मात्रा तथा समयका समस्याहरू बुझ्न रेडक्स चक्रमा भाग लिने पदार्थहरूको प्रयोगशालामा गरिने व्यवस्थापन।