Artikkel
Reduksjonstest med metylenblått for melk: prinsipp og begrensninger
En student holder opp to prøverør med melk. Det ene ble hvitt på en time. Det andre forble blått i fem timer. Hun peker på det blå og sier at melken er trygg å drikke.
Den konklusjonen avslører en feilaktig forståelse. Melketesten med metylenblått påviser ikke trygghet. Den viser hvor raskt mikroorganismene i prøverøret senker redokspotensialet under fastsatte betingelser. Et langsomt resultat betyr lav samlet metabolsk aktivitet i prøven. Det sier ingenting om hvilke organismer som er til stede, om noen av dem er sykdomsfremkallende, eller om melken ble pasteurisert riktig.
Skillet er viktig fordi testen virker overbevisende. Blåfargen forsvinner. En klokke gir et tall. Tall innbyr til overtolkning. Denne artikkelen beholder den nyttige tolkningen og setter en grense for den utrygge.
Hva reduksjon faktisk måler
Metylenblått er blått når det er oksidert, og nesten fargeløst når det er redusert til leukometylenblått. Fersk melk inneholder oppløst oksygen, som holder fargestoffet blått. Bakterier som utfører respirasjon og fermentering, forbruker dette oksygenet og frigjør reduserende forbindelser. Når redokspotensialet faller tilstrekkelig, tar fargestoffet opp elektroner og mister fargen. Lærebokteksten om meierimikrobiologi fra University of Guelph beskriver den samme sekvensen som fjerning av oksygen etterfulgt av dannelse av reduserende stoffer under bakterienes metabolisme.
Klassiske arbeider i Journal of Dairy Science beskriver dette som en prosess i to trinn: Først tømmer mikrofloraen prøven for oksygen, deretter reduserer bestanddeler i melken fargestoffet raskt. Reduksjonstesten med metylenblått for melk forstås derfor best som en funksjonell analyse av samlet metabolsk aktivitet, ikke som en celletelling. Redoksegenskapene til metylenblått forklarer kjemien bak denne overgangen.
Oksygen reverserer endepunktet. Redusert leukofargestoff som utsettes for luft, oksideres igjen og blir blått på nytt. Risting, helling, brede prøverør og stort luftrom over prøven forsinker derfor resultatet. En tynn blå ring blir ofte stående ved overflaten mot luften etter at resten av innholdet har mistet blåfargen. Standardprosedyrer godtar denne ringen i stedet for å vente på at den skal forsvinne.
Organismetypen tilfører en annen feilkilde. Koliforme bakterier og mange melkesyrebakterier reduserer fargestoffet raskt. Mange psykrotrofe og termoduriske organismer reduserer det langsomt eller nesten ikke i det hele tatt. To melkeprøver med samme kimtall ved dyrking på agar kan miste blåfargen med flere timers mellomrom. Dette alene utelukker å omregne tid til antall kolonier.
En kontrollert laboratorieprosedyre
Feltmetoder og lærebokversjoner varierer i detaljene, så et resultat er bare gyldig innenfor metoden som ga det. En vanlig versjon for næringsmiddellaboratorier utføres slik:
- Ta en prøve av rå melk med minst mulig luftinnblanding, og kjøl den raskt ned. Bland ved forsiktig vending før uttak av delprøven.
- Tilsett 10 mL melk i et sterilt prøverør med 1 mL fargestoffløsning til bruk i testen. En mye brukt konsentrasjon er 0.005 prosent fargestoff, med et forhold mellom melk og fargestoffløsning på 10 til 1.
- Sett propp i prøverøret, vend det forsiktig to ganger, og plasser det i et vannbad innen få minutter. Vanlig inkubasjonstemperatur er 35 til 38 grader Celsius, avhengig av hvilken standard som brukes. Noter hvilken du følger.
- Beskytt prøverørene mot lys under inkubasjonen, siden lys fremskynder reduksjonen.
- Les av etter 30 minutter, deretter med faste intervaller. Endepunktet er tidspunktet når prøverøret samsvarer med en referanse av kokt melk eller når det fargetapet som prosedyren definerer.
- Behold et ubehandlet prøverør med samme melk som visuell kontroll der metoden krever det.
FAOs håndbok for melketesting beskriver en konkret feltversjon av denne fremgangsmåten med 10 mL melk pluss 1 mL fargestoffløsning, propp, forsiktig vending, inkubasjon nær 37 til 38 grader og avlesninger hvert 30. minutt. Kontrollrørene bruker kokt melk for å ødelegge det naturlige reduksjonssystemet og gi et fast grunnlag for fargesammenligningen.
Skjemaet ovenfor viser rammene for kontrollen. Samme volumer, samme fargestoff, samme temperatur, samme blanding, samme lysbeskyttelse, samme regel for endepunktet. Endrer du én av disse, endres også tiden. Derfor kan hjemmeversjoner som bruker en vilkårlig fargestoffkonsentrasjon, ikke sammenlignes med laboratoriets kvalitetsklasser.
Hva reduksjonstiden indikerer
Lengre tid betyr lavere samlet aktivitet under de oppgitte betingelsene. Kortere tid betyr høyere samlet aktivitet. Undervisningstabeller for meierifaget knytter grove kvalitetsklasser til disse tidene, for eksempel 5 eller flere timer som svært god og under 30 minutter som dårlig i ett klassifiseringssystem basert på BIS.
Variasjonen er poenget. Et resultat på 5 timer har ingen universell kvalitetsklasse. Det hører til prosedyren som definerte det. Et faglig forsvarlig rapportformat er derfor:
MBRT er lik X timer med angitt metode, tilsvarende denne metodens kvalitetsklasse.
Det er aldri MBRT er lik X kolonidannende enheter per mL. Veiledning basert på Standard Methods sier at resultater fra fargestoffreduksjon ikke skal rapporteres som bakterietall. Prosedyren for enkel farging med metylenblått besvarer også et annet spørsmål, siden den viser celleform i mikroskopet snarere enn samlet aktivitet i et prøverør.
Tabell over tolkning og begrensninger
Denne tabellen er artikkelens opprinnelige referanse. Les hele raden på tvers. Ingen enkeltcelle står alene.
| Observasjon eller påstand | Hva det indikerer | Hva det ikke kan bevise | Viktigste feilkilder |
|---|---|---|---|
| Raskt tap av blåfarge, under 2 timer i ett klassifiseringssystem for rå melk | Høy reduserende aktivitet, forenlig med stor mikrobebelastning eller dårlig holdbarhet | Art, nøyaktig antall, toksiner eller svikt i pasteuriseringen | Varm lagring, mikroflora rik på koliforme bakterier, lys, lav mengde fargestoff |
| Middels tid, 2 til 4 timer | Moderat aktivitet; kvalitetsklasse bare innenfor det angitte systemet | Trygghet eller fravær av organismer som reduserer langsomt | Høy inkubasjonstemperatur, forskjeller i luftinnblanding, fettseparasjon |
| Langsom reduksjon, 5 eller flere timer | Lav samlet aktivitet i dette systemet | Fravær av sykdomsfremkallende organismer, pasteurisering eller kjemisk trygghet | Antibiotikarester, konserveringsmidler, ekstra oppløst oksygen, høy mengde fargestoff |
| Blå ring blir stående ved overflaten mens resten mister fargen | Reoksidasjon i grenseflaten mot luft, en normal randeffekt | Mislykket test eller ufullstendig reaksjon | Bredt prøverør, løs propp, gjentatt åpning for inspeksjon |
| Hvitt prøverør etter inkubasjon av oppvarmet melk | Endret reduksjonssystem sammen med aktivitet som har overlevd | At oppvarmingen tilsvarte validert pasteurisering | Varmeskade, reparasjon under inkubasjon, senere kontaminering |
| En enkelt MBRT-verdi oppgitt uten metode | Ukjente testbetingelser | Noen kvalitetsklasse eller noe antall | Fargestofformulering, forhold, temperatur, blanding og regel for endepunkt er ikke oppgitt |
Vekstbaserte undersøkelser, som dyrking på bakteriemedier, er fortsatt veien til telling og isolering. Reduksjonsrøret gir en screening. Agarskålen identifiserer og teller.
Hva testen ikke kan bevise om trygghet
Et langsomt resultat kan ikke bevise fravær av sykdomsfremkallende organismer. En sykdomsfremkallende organisme som finnes i en klinisk relevant mengde, kan bidra lite til det samlede oksygenforbruket. Påvisning av sykdomsfremkallende organismer hører til organismespesifikke metoder, som gjeldende Standard Methods behandler som et eget område, atskilt fra generell kvalitetsscreening.
Den kan ikke bekrefte pasteurisering. Kontroll av varmebehandling bruker testing for alkalisk fosfatase eller en annen validert metode i tråd med Codex-retningslinjene for meierihygiene. Et hvitt eller blått prøverør sier ingenting om hvilke temperaturer partiet har vært utsatt for, eller hvor lenge.
Den kan ikke sertifisere mattrygghet. Tryggheten avhenger av sykdomsfremkallende organismer, allerede dannede toksiner, legemiddelrester, kjemiske forurensninger, kjølekjedens historikk og kontaminering etter prøvetaking. Codex behandler trygghet for meieriprodukter som en kjede av kontrolltiltak, ikke som ett screeningresultat.
Næringsmiddellaboratoriets rammer er ikke hjemmetesting
I et meierilaboratorium brukes testen til screening av melk ved mottak, sammenligning av leverandører over tid eller undervisning i redoksmikrobiologi under veiledning. Prøvene er sporbare. Reagensene er standardiserte. Temperaturene loggføres. Avfallet håndteres som laboratorieavfall.
Hjemmetesting har ingen av disse rammene. Volumer målt på kjøkkenet er omtrentlige. Konsentrasjonen i fargestoffer som selges på nettet, varierer mye. Inkubasjonen skjer ofte i et varmt rom fremfor i et kalibrert vannbad. Fargeendringen skjer likevel, noe som får resultatet til å virke pålitelig selv om alle kontrollene som ga det mening, mangler.
Den større risikoen ligger i atferden. Et blått prøverør hjemme kan friste til å drikke rå melk som et laboratorium fortsatt ville sendt til kimtallsbestemmelse, screening for sykdomsfremkallende organismer og kontroll av reststoffer. Melketesten med metylenblått ble utviklet for å kvalitetsklassifisere rå melk ved mottak, ikke for å godkjenne melk til konsum. Raskere screening med resazurin har den samme begrensningen: raskere fargeavlesning, men fortsatt ikke noe svar om sykdomsfremkallende organismer.
En kort regel for laboratoriebenken
Standardiser fargestoff, forhold, temperatur, blanding, lys og endepunkt. Rapporter tiden sammen med metodenavn og kvalitetsklasse. Tolk minuttene i lys av lagringshistorikk, type mikroflora, reststoffer og prøvetakingskvalitet. Kort tid varsler om aktivitet som bør undersøkes. Lang tid bekrefter aldri trygghet.