Metylenblått i sebrafiskforskning: tilsetningsstoff ved dyrehold og konfunderende faktor i eksperimenter

Eggvann for sebrafisk er ofte svakt blått, og nesten ingen skriver ned hvorfor. Fargestoffet er metylenblått, tilsatt mot sopp, og de fleste protokoller behandler det som bakgrunn. Bakgrunn er feil begrep her. Et bedre begrep er en uregistrert eksperimentell faktor: noe som finnes i behandlede skåler og mangler i kontrollene, er farmakologisk aktivt ved konsentrasjonene som brukes, og kan påvirke nettopp de endepunktene eksperimentet måler.

Dette skillet ligger til grunn for alt som følger. Rutinemessig soppforebygging ved dyrehold er ett spørsmål. Om tilsetningsstoffet er nøytralt i analysen din, er et annet. Den nyere sebrafisklitteraturen gir et betryggende svar på det første og et ubehagelig svar på det andre.

Hva retningslinjene faktisk foreskriver

Det finnes ingen felles standard, og det er en del av problemet. Veiledningen fra Canadian Council on Animal Care tillater 0.5 mg/L, eller 0.00005%, i transportløsning for egg og larver for å redusere soppvekst. Europeisk veiledning om forsøksdyr beskriver embryoer som holdes i medium som ofte inneholder de samme 0.00005%. E3-oppskriften fra Cold Spring Harbor angir det dobbelte, 1 mg/L eller 0.0001%, som en ingrediens. Dette står i kontrast til en påfallende utelatelse: OECDs retningslinje for toksisitetstesting på fiskeembryoer angir rekonstituert fortynningsvann og testkjemikalie, uten noen anbefaling om metylenblått verken i 2013-versjonen eller i den senere revisjonen. Dermed oppdretter ett laboratorium sebrafiskembryoer i blått vann med metylenblått fra de første levetimene, mens et annet gjennomfører den regulatoriske embryoanalysen i klart vann, og begge kaller mediet sitt normalt. Alle som sammenligner resultater mellom laboratorier eller slår sammen historiske kontrolldata, arver denne inkonsistensen.

For å sette konsentrasjonene i perspektiv er 0.00005% omtrent 1.56 mikromolar og 0.0001% omtrent 3.13 mikromolar. Dette er lave tall, og det er fristende å tolke dem som for lave til å ha betydning. Studiene nedenfor tester nettopp denne antakelsen, ved nettopp disse konsentrasjonene.

Lesere som kommer fra akvariehold snarere enn laboratoriet, møter det samme molekylet i en annen sammenheng, omtalt i akvarieguiden til metylenblått. Kjemien er den samme; gjennomgangen av hvordan fargestoffet transporterer elektroner gjennom celler, forklarer hvorfor en redoksaktiv forbindelse stadig dukker opp i artikler om metabolisme. Det som følger, gjelder spesifikt eggvann for sebrafisk med metylenblått.

Metabolisme: effekten skifter fortegn med utviklingsstadiet

Den mest informative studien eksponerte normalt utviklende sebrafisk fra første levedag til 5 dager etter befruktning og målte oksidativ metabolisme på hvert stadium, slik den publiserte rapporten om embryometabolismeforsøkene beskriver. Mønsteret bør beskrives nøye fordi retningen snur.

Ved 1 dag etter befruktning økte det basale oksygenforbruket hos eksponerte embryoer ved begge konsentrasjonene som brukes ved dyrehold. Ved 2 dager var mitokondrielt membranpotensial i larvenes overflatelag forhøyet ved eksponering for 0.00005%, 0.0001% og 0.0003%. Ved 4 til 5 dager, etter klekking, hadde fortegnet snudd: det oksidative energiforbruket falt, enten eksponeringen hadde vært kontinuerlig siden befruktning eller akutt bare fra dag 3 til dag 4. Samtidig ble nivåene av transkripter for underenheter i mitokondrienes respirasjonskomplekser redusert ved både 1 og 4 dager, sammen med transkripter knyttet til steroidogenese og glukoneogenese.

To ytterligere observasjoner gjør bildet tydeligere. Klekkingen skjedde litt tidligere ved den høyere konsentrasjonen som brukes ved dyrehold: eksponerte embryoer lå foran ved 2 dager, mens kontrollene hadde tatt dem igjen ved dag 3. Selve stressaksen så dessuten ut til å være intakt: da 5 dager gamle larver ble utsatt for en stresspåvirkning i form av virvelbevegelse, steg kortisolnivået i hele kroppen normalt i begge grupper. Fargestoffet er altså ikke et generelt utviklingstoksisk stoff ved disse dosene, og det demper ikke alle fysiologiske responser. Det påvirker energimetabolismen på en stadieavhengig måte, opp før klekking og ned etterpå.

Atferd: hvorfor to studier er uenige, og hvorfor begge kan ha rett

Atferdslitteraturen ser selvmotsigende ut helt til eksponeringsoppsettene sammenlignes side om side. En sikkerhetsstudie av utvikling og atferd eksponerte embryoer fra omtrent 6 timer etter befruktning for konsentrasjoner opptil 10 mikromolar, fornyet løsningene daglig til og med dag 4, flyttet deretter larvene til fargestoffritt medium på dag 5 og 6 og testet bevegelsesaktivitet i en lys–mørke-analyse på dag 6. Resultatet: ingen signifikant effekt på dødelighet, klekking eller morfologi, og ingen behandlingseffekt på bevegelsesaktivitet. Forfatterne anbefalte med rimelig grunn 10 mikromolar som en øvre grense under sine betingelser.

En annen gruppe, med noen av de samme forfatterne som i metabolismestudien, gjennomførte eksponeringen slik dyreholdet faktisk foregår: fargestoff til stede fra 2 til 3 timer etter befruktning, med daglig delvis utskifting, og atferd målt mens eksponeringen pågikk eller nylig hadde opphørt. Ved de samme rutinekonsentrasjonene viste larvene redusert bevegelsesaktivitet i en 24-timers analyse, et funn som lot seg gjenta på tvers av stammer og laboratorier. Studien av atferdsmessig konfundering knyttet effekten til serotonerg tonus, i samsvar med fargestoffets kjente hemming av monoaminoksidase. Mest avslørende var det at embryomedium med metylenblått maskerte den forventede bevegelsesresponsen på SSRI-et fluoksetin. En screeninganalyse utført i blått vann kan derfor overse en legemiddeleffekt som klart vann ville avdekket.

Det er ingen reell motsetning. En forbindelse kan være uten påvisbar gjenværende effekt to dager etter utvasking i én analyse og samtidig være aktiv mens den er til stede i en annen. Den praktiske tolkningen er at nullfunnet gir grunnlag for en øvre konsentrasjonsgrense, ikke en påstand om nøytralitet, mens det positive funnet beskriver den relevante risikoen: aktiv eksponering i måleperioden, i akkurat det oppsettet de fleste laboratorier bruker.

Et redoksfargestoff i en redoksanalyse

Enda en fallgruve fortjener et eget avsnitt fordi den forstyrrer måleinstrumentet snarere enn dyret. Alamar Blue-analysen av energiforbruk bygger selv på redokskjemi: resazurin reduseres til fluorescerende resorufin. Metylenblått er også redokskjemi. I cellefrie kontroller reduserte begge konsentrasjonene som brukes ved dyrehold, Alamar Blue-fluorescensen svakt, men signifikant, etter 24 timer. I dyreforsøkene ble eksponerte embryoer vasket minst tre ganger i fargestoffritt medium før analysen, og den biologiske effekten hos klekkede larver var større enn den cellefrie interferensen. Begge deler er derfor sant: vaskede dyr har en reell metabolsk effekt, og fargestoff som ikke er vasket bort, tilfører en direkte kjemisk artefakt i tillegg. Kontrollene må skille de to, ellers er ingen av tallene meningsfulle. Generell veiledning om tolkning av fargestoffbaserte analyseresultater er spesielt relevant her.

Tidslinje for utviklingsstadier

Den originale oversikten for denne artikkelen. Konsentrasjonene er de to standardverdiene for dyrehold, 0.00005% og 0.0001%, med mindre annet er angitt.

Mønsteret å huske er en tidlig økning og et senere fall i metabolske endepunkter, med atferdseffekter til stede under eksponering og uten påvisbar effekt etter utskillelse i den ene analysen som undersøkte dette.

Sjekkliste for kontrolldesign

Det andre originale verktøyet. Bruk det når protokoller for sebrafisk med metylenblått inngår i et eksperiment.

1. Rapporter fargestoffet som et reagens, ikke som vann. Oppgi konsentrasjon i både prosent og mikromolar, start og slutt i timer eller dager etter befruktning, utskiftingsplan og utvaskingsintervall før hver måling.
2. Tilpass kontrollene til spørsmålet. En studie av testkjemikaliet trenger fargestoffrie kontroller; en studie av dyrehold trenger forsøksgrupper uten og med fargestoff, med registrering av utfallet for soppforebygging, siden ingen av de siterte studiene målte sopphemmende effekt.
3. Vask før redoksanalyser, og kontroller deretter. Skyll minst tre ganger i fargestoffritt medium og kjør samtidig en cellefri kontroll med fargestoff og reagens, fordi fargestoffet reduserer Alamar Blue-signalet direkte.
4. Behandle atferds- og monoaminendepunkter som høyrisikoområder. Studier av bevegelsesaktivitet, skvetterespons, angstlignende atferd, antidepressiva og MAO-hemmere bør unngå fargestoffet under måling eller dokumentere endepunktspesifikk nøytralitet; utvasking i én til to dager fjernet én effekt på bevegelsesaktivitet, men dette er ikke dokumentert for andre forsøksoppsett.
5. Behandle metabolske og mitokondrielle endepunkter som høyrisikoområder på hvert stadium. Oksygenforbruk, energiforbruk, membranpotensial og transkripter for respirasjonskjeden endres ved konsentrasjonene som brukes ved dyrehold, i motsatte retninger før og etter klekking.
6. Ikke overfør nøytralitet mellom forsøksoppsett. Et nullfunn etter utvasking gjelder ikke for pågående eksponering; et nullfunn for morfologi gjelder ikke for metabolisme eller legemiddelinteraksjon; et resultat for én stamme, temperatur eller analysevarighet gjelder ikke for andre.
7. Oppgi retningslinjen du fulgte, og alternativet til den. Angi uttrykkelig konsentrasjonene fra CCAC, europeisk veiledning eller Cold Spring Harbor, og påpek hvor OECDs embryotest utelater fargestoffet, slik at leseren kan sette forsøksdyrene dine i riktig sammenheng.

Ingenting av dette taler mot å bruke fargestoffet for å holde egg i live. Det taler mot å la et valg i dyreholdet følge uundersøkt med inn i dataene. Det blå i skålen er et molekyl med farmakologiske egenskaper, og eksperimentene som mest sannsynlig blir forstyrret, er nettopp de metabolske og nevroatferdsmessige screeningene med høy gjennomstrømning som unge sebrafisk nå foretrekkes til. Registrer det, kontroller for det, vask det ut før du måler, og undersøk analysen det kanskje deltar i uten at du merker det.