Metylenblått i G6PD-laboratorietester: hva fargestoffet faktisk gjør

En student betrakter to prøverør etter inkubasjon. Det ene har fått den forventede fargen. Det andre har ikke det. Studenten konkluderer med at den andre pasienten har mangel på glukose-6-fosfatdehydrogenase. Konklusjonen kan være riktig, men resonnementet hopper over prinsippet som får testen til å fungere. Ingenting i prøverøret måler enzymet direkte. Prøverøret måler det enzymet produserer, med metylenblått som mellomledd.

Når denne indirekte sammenhengen er forstått, fremstår verken prosedyren, kontrollene eller den lange listen over feilaktige resultater som vilkårlige.

Det korte svaret

Metylenblått i G6PD-testing er en redoksindikator. Enzymet G6PD danner NADPH, og NADPH-avhengige systemer reduserer blått metylenblått til dets fargeløse leukoform (eller bruker det til å overføre elektroner). Normal enzymaktivitet gir effektiv reduksjon. Mangelfull aktivitet gir langsom eller ufullstendig reduksjon. Det er hele signalet.

To historiske metoder bruker det samme fargestoffet, men har ulike endepunkter. Hold dem fra hverandre, så forsvinner det meste av forvirringen.

To tester, ett fargestoff, ulike endepunkter

Den første er den direkte reduksjonstesten med metylenblått, beskrevet av Sass og kolleger og senere evaluert av Gibbs. Her er endepunktet selve fargestoffet: oksidert blått metylenblått reduseres mot fargeløst leukometylenblått, og hastigheten på denne endringen gjenspeiler kapasiteten til å danne NADPH. Den opprinnelige screeningartikkelen er indeksert på PubMed under Sass et al. (1966).

Den andre er Brewers methemoglobinreduksjonstest. Natriumnitritt oksiderer først hemoglobin til brunt methemoglobin. Metylenblått fungerer deretter som en mediator for elektronoverføring: redusert metylenblått overfører reduksjonsekvivalenter til methemoglobin og omdanner det tilbake til rødt hemoglobin. Det synlige endepunktet er derfor brunt mot rødt, ikke blått mot fargeløst. Den opprinnelige metoden ble publisert i Bulletin of the World Health Organization (Brewer et al., 1960).

Å kalle Brewer-analysen en avfargingstest er kjemisk upresist. Fargestoffet går i en syklus; hemoglobinet skifter farge. Diagrammet nedenfor viser begge reaksjonsveiene.

Den underliggende reaksjonen

G6PD katalyserer det første oksidative trinnet i pentosefosfatveien:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Modne røde blodceller er sterkt avhengige av denne reaksjonsveien for NADPH, som gjennomgått i Blood av Luzzatto og kolleger (2020). NADPH holder glutation redusert og beskytter cellen mot oksidativ skade. Metylenblått inngår i dette systemet som en elektronakseptor. Tilstrekkelig G6PD gir tilstrekkelig NADPH, som gir effektiv reduksjon. Lavt G6PD bryter kjeden i det første leddet.

Tenk på fargestoffet som en drivstoffmåler, ikke motoren. Det viser tilgangen på NADPH. Alt annet som endrer denne tilgangen, eller avlesningen, kan flytte nålen uten noen endring i genet.

Slik utføres en prosedyre av Brewer-typen

Reagensoppskriftene har variert gjennom flere tiår, så en beskrivelse til undervisningsbruk må ikke forveksles med en klinisk protokoll. Hvert laboratorium følger sin egen validerte standardprosedyre. Med dette forbeholdet fungerer det klassiske prøverøroppsettet som følger, i en utgave dokumentert med tre prøverør og 3 timers inkubasjon i denne publiserte gjennomføringen:

1. Pasientrør: fullblod tilsatt glukose, natriumnitritt og metylenblått. Nitritt danner methemoglobin, glukose forsyner de røde blodcellenes stoffskifte, og fargestoffet sørger for den NADPH-avhengige elektronoverføringen.
2. Oksidert kontroll: blod tilsatt nitritt og glukose, men uten metylenblått. Den viser det brune methemoglobinendepunktet, som er mønsteret ved mangel.
3. Hemoglobinkontroll: blod tilsatt vann. Den viser det røde hemoglobinendepunktet, som er det normale mønsteret.
4. Inkuber alle prøverørene ved omtrent 37 C, vanligvis i 3 timer, med forsiktig blanding.
5. Fortynn en liten alikvot fra hvert prøverør i destillert vann for å lysere cellene og gjøre fargesammenligningen tydelig.
6. Sammenlign pasientrøret med de to kontrollene. En tilbakegang mot rødt tyder på betydelig reduksjonskapasitet. Vedvarende brunfarge tyder på uttalt mangel.

En historisk formulering brukte omtrent 1 mL blod med reagenser på rundt 180 mM natriumnitritt, 280 mM dekstrose og 0.4 mM metylenblått. Betrakt disse tallene som et eksempel fra litteraturen, ikke som en universell spesifikasjon.

Avlesning av resultatet

En kvalitativ screening skiller best ved rundt 30 til 40 prosent av normal aktivitet, som diskutert i denne oversiktsartikkelen i Malaria Journal om mangler ved påvisning av G6PD-mangel. Et normalt screeningresultat betyr derfor at analysen ikke påviste alvorlig mangel. Det bekrefter ikke fullt normal aktivitet.

Hvorfor screening kan villede

Retikulocytose etter hemolyse er den klassiske årsaken til et falskt normalt resultat. Unge røde blodceller og retikulocytter inneholder mer G6PD enn gamle celler. Under en akutt hemolytisk episode kan de eldste cellene, med størst enzymmangel, allerede være ødelagt. Da gjenstår en ung cellepopulasjon med aktivitet som gir et normalt testresultat. Den samme biologien villeder også kvantitative analyser, ikke bare screening med fargestoff.

Nylig transfusjon skjuler mangel fordi donorens røde blodceller bidrar med sitt eget enzym til prøven. Mayo Clinic Laboratories oppgir transfusjon blant årsakene til upålitelige enzymresultater, sammen med retikulocytose og leukocyttinterferens.

Heterozygote kvinner er den vanskeligste gruppen. Tilfeldig inaktivering av X-kromosomet gir en blanding av normale røde blodceller og celler med enzymmangel, og den samlede aktiviteten kan ligge hvor som helst fra alvorlig mangel til tilsynelatende normal. Kvalitativ screening overser ofte intermediære fenotyper. WHOs dokumentasjon om G6PD-testing drøfter denne begrensningen i detalj.

Prøvens alder, lagringstemperatur, subjektiv visuell vurdering av endepunktet, hematokrit og reagenskvalitet gir analytisk støy i tillegg til disse biologiske effektene.

Screening er ikke diagnostikk

Et screeningresultat som tyder på mangel, er intermediært eller ikke samsvarer med det kliniske bildet, krever en kvantitativ G6PD-enzymanalyse. WHO regner temperaturkontrollert kvantitativ spektrofotometri som referansemetoden. I denne analysen tilsettes glukose-6-fosfat og NADP+ til et hemolysat av røde blodceller, og NADPH som dannes, følges gjennom økende absorbans ved 340 nm. Endringshastigheten er proporsjonal med enzymaktiviteten, som vanligvis normaliseres til hemoglobin og oppgis i enheter per gram. Gjeldende praksis i kliniske laboratorier er oppsummert i oppføringen for G6PD-aktivitet i Mayos testkatalog.

Tolkningen bygger på laboratoriets validerte referanseområde, ofte uttrykt i forhold til normal aktivitet i befolkningen. Mangel omtales vanligvis med utgangspunkt i terskelen på 30 prosent, med intermediær aktivitet over denne. WHOs målproduktprofiler for G6PD-tester (2022) beskriver dette diagnostiske rammeverket. Hvis nylig hemolyse eller transfusjon gjør fenotyping upålitelig, gjentas testen etter at den røde blodcellepopulasjonen har stabilisert seg igjen. Molekylær testing kan gi tilleggsinformasjon uten å erstatte enzymmålingen.

Et skille det er verdt å bevare

Metylenblått i disse analysene er et ex vivo-laboratoriereagens. Dette må holdes atskilt fra diskusjonen om sikkerheten ved å gi metylenblått til en pasient, som dekkes i veiledningen om kontraindikasjoner for metylenblått. Biokjemien forbinder dem, siden legemiddelet også er avhengig av NADPH-avhengig reduksjon, men et fargestoff i et prøverør er ikke en dose i blodbanen. For bakgrunn om hvordan fargestoffet fungerer som fargemiddel i en annen sammenheng, se prinsipper for farging med metylenblått, og for den kjemiske familien det tilhører, redoksfargestoffer i laboratoriet.

Screening undersøker om reduksjonskapasiteten ser intakt ut. Bekreftende testing undersøker hvor mye enzym som faktisk er til stede. Fargestoffet besvarer det første spørsmålet godt, så lenge ingen ber det besvare det andre.