Metylenblått til farging av DNA og RNA: bruk i geler og på membraner

En student kjører en agarosegel, farger den med metylenblått og ser ingenting der et tydelig bånd var forventet. Ved nabobenken farger en postdoktor en Northern-membran med den samme blå flasken og får skarpe ribosomale bånd på tre minutter. Studenten konkluderer med at gelkjøringen mislyktes. Det gjorde den ikke. De to oppgavene var forskjellige, og det samme fargestoffet løser dem med ulik følsomhet, ulik bakgrunn og ulike regler for det som skjer etterpå.

DNA-farging og RNA-farging med metylenblått bygger på samme kjemi, men har ikke samme formål. I en gel viser fargestoffet hvor mye nukleinsyre som finnes inne i en porøs matriks. På en membran viser det om overføringen fungerte, og om banene ble lastet jevnt. Når dette skillet er klart, faller protokollene, deteksjonsgrensene og kompatibilitetsbegrensningene på plass.

Det korte svaret

Metylenblått er et plant, kationisk fargestoff som binder nukleinsyrer ikke-kovalent og reversibelt gjennom en kombinasjon av elektrostatisk tiltrekning til fosfat, interkalering mellom basepar og binding i den lille furen. Det er nettopp reversibiliteten som er poenget. Bånd kan farges og dokumenteres i synlig lys, og deretter avfarges eller renses for kloning, hybridisering eller ny probing.

Ved farging av dobbelttrådet DNA med metylenblått i agarosegel er standardoppskriften for rask farging 0.02 prosent w/v (200 mikrogram per mL) i vann, omtrent 15 minutters farging pluss omtrent 15 minutters avfarging i vann, med avlesning på en lyskasse med hvitt lys. For membraner er den klassiske Northern blot-oppskriften 0.02 til 0.04 prosent fargestoff i natriumacetat ved omtrent pH 5.2, flere minutters farging etter overføring og immobilisering, deretter skylling i vann og full avfarging før hybridisering. Følsomheten er moderat: titalls til hundrevis av nanogram per gelbånd under gode forhold, mens konservative veiledninger oppgir 0.5 til 1 mikrogram. Det er flere størrelsesordener over etidiumbromid og SYBR-fargestoffer. På membraner finnes det ingen nyttig deteksjonsgrense for enkelttranskripter, fordi fargingen hovedsakelig viser ribosomalt RNA som forekommer i store mengder, og den totale mengden påført materiale. Ikke bruk en kosttilskuddsløsning fra detaljhandelen i noen av oppskriftene. Validerte metoder forutsetter fargestoff av analytisk kvalitet, definerte buffere og RNase-fri håndtering når RNA er involvert.

Hvordan bindingen fungerer, og hvor den kan villede

Den nyttige modellen har tre deler. For det første tiltrekkes det positivt ladede ringsystemet av den negativt ladede fosfatryggraden. Spektroskopiske studier viser at dette elektrostatiske bidraget dominerer ved lav saltkonsentrasjon, mens modellering og molekyldynamikk viser interkalering og binding i den lille furen som stabile bindingsmåter for dobbelttrådet DNA, som oppsummert i en spektroskopisk studie av metylenblåtts binding til DNA. For det andre finnes det en viss GC-preferanse. Modellering favoriserer CpG- og GpC-trinn, og eksperimenter rapporterer foretrukket binding til GC-rike duplekser i forskning på metylenblåtts interkaleringspreferanser, men AT-duplekser binder også fargestoffet. Rutinemessig farging er ikke sekvensspesifikk. For det tredje binder enkelttrådet DNA og RNA hovedsakelig gjennom elektrostatiske interaksjoner og stabling med tilgjengelige baser og dupleksregioner. Derfor varierer fargingsstyrken med lengde, sekvens og sekundærstruktur.

Dette har to konsekvenser. Fordi bindingen er ikke-kovalent, vaskes fargestoffet ut. Bånd i polyakrylamid blekner raskt med mindre de fikseres med hensikt, og en egen variant med permanent fiksering finnes nettopp fordi vanlig farging er midlertidig, som beskrevet av Soto og Draper for PAGE-geler. Fordi fargestoffet er en fotosensibilisator, kan langvarig, sterk belysning av farget DNA i nærvær av oksygen oksidere guanin og etter hvert gi enkelttrådbrudd, en mekanisme som er beskrevet i forskning på guanिनoksidasjon sensibilisert av metylenblått. Kortvarig avlesning i hvitt lys unngår den velkjente UV-skaden fra klassiske arbeidsflyter med etidiumbromid, og denne fordelen er reell ved preparativ isolering. Synlig lys er mer skånsomt, ikke ufarlig. Hold belysningstiden kort når DNA-et skal klones. For den bredere fotokjemien bak denne forsiktighetsregelen, se de to reaksjonsveiene i metylenblåtts fotokjemi. For redoksparet og ladningstilstandene som forklarer hvorfor den oksiderte formen binder og den reduserte formen ikke gjør det, se kjemien bak metylenblåtts struktur og egenskaper.

Oppgave én: farging inne i geler

Gelfarging besvarer ett spørsmål: Er det nok nukleinsyre i dette båndet til at det kan ses med øyet? Dobbelttrådet DNA i agarose er det best karakteriserte tilfellet. Den opprinnelige gelfargingsmetoden med metylenblått fra Flores og kolleger validerte hurtigprotokollen med 0.02 prosent på 1 prosent agarose og viste vellykket isolering og kloning etterpå. Den samme leverandørprotokollen finnes på IBI Scientifics produktside for metylenblått, som oppgir membranoppskriften med 0.04 prosent og hurtigvarianten for geler side om side.

Praktisk arbeidsflyt:

1. Kjør gelen som vanlig. Farg etter elektroforesen, ikke under den, med mindre overføring eller oppløsningsevne er validert for en modifisert metode.
2. Senk gelen ned i 0.02 prosent w/v metylenblått i destillert vann, med forsiktig bevegelse, i omtrent 15 minutter.
3. Avfarg med flere vannbytter, omtrent 15 minutter totalt, til bakgrunnsfargen i matriksen avtar og båndene trer frem.
4. Fotografer straks på en lyskilde med hvitt lys.

Agarose og polyakrylamid oppfører seg forskjellig. Agarose holder fargestoffet tilbake i matriksen, så avfargingen er det langsomme trinnet. Tynne polyakrylamidgeler farges raskt, men mister også fargestoffet raskt. Det er en fordel ved preparativ utskjæring, men en ulempe for varig dokumentasjon. Syntetiske oligonukleotider i polyakrylamid kan lokaliseres med den samme oppskriften med 0.02 prosent på 20 til 30 minutter med gjentatte vannvasker, etter etablerte PAGE-metoder av typen som beskrives i Current Protocols. Svært fortynnede varianter rundt 0.0002 prosent i fortynnet TBE er rapportert for preparativ behandling av oligonukleotider over flere timer, men dokumentasjonsgrunnlaget er svakere.

Forskjellen mellom DNA og RNA har betydning. Dobbelttrådet DNA gir den sterkeste strukturerte bindingen. RNA og enkelttrådet DNA farges, men svakere og mindre forutsigbart. For RNA-geler med formaldehyd og agarose hopper de fleste laboratorier over blåfarging i gelen og overfører RNA-et til en membran først, før de farger der. Dette bytter ut et svakt gelsignal med et skarpere membransignal og samtidig dokumentasjon av prøvelastingen.

Oppgave to: farging på membraner

Membranfarging besvarer et annet spørsmål: Fungerte overføringen, og er banene sammenlignbare? Den klassiske bruken er Herrin og Schmidts reversible Northern blot-farging, opprinnelig med 0.04 prosent fargestoff i 50 mM natriumacetat ved pH 5.0 i 2 til 3 minutter med skylling i vann, og med fjerning av fargestoffet med fortynnet SDS i SSPE før hybridisering.

Den mye brukte moderne varianten utføres slik:

1. Overfør RNA eller denaturert DNA til nylon eller nitrocellulose, og immobiliser deretter ved UV-kryssbinding eller varmebehandling slik at prøven ikke går tapt under fargingen.
2. Valgfritt, men vanlig: Fukt membranen i 5 prosent eddiksyre i omtrent 15 minutter.
3. Farg i 5 til 10 minutter i 0.02 til 0.04 prosent metylenblått i 0.3 til 0.5 M natriumacetat ved omtrent pH 5.2.
4. Skyll og avfarg i vann i 5 til 15 minutter, dokumenter, og fjern deretter gjenværende fargestoff før hybridisering.

Positivt ladet nylon dominerer i Northern-arbeid. Nitrocellulose fungerer også med den samme arbeidsflyten med eddiksyre og acetat. Bildet brukes til å bekrefte overføring, sammenligne 28S- og 18S-bånd (eller 23S og 16S for bakterielt RNA), markere størrelsesmarkører og standarder og bevare et grovt grunnlag for normalisering mot totalt RNA. Publiserte Northern-metoder kvantifiserer fargede ribosomale bånd for å kontrollere prøvelastingen, blant annet meierifaglig forskning som brukte ribosomale bånd farget med metylenblått til normalisering. Southern-membraner kan visualiseres på samme måte, men fargestoffet er langt mer etablert som kontroll av prøvelasting og overføring ved Northern blot. DNA ved Southern blot denatureres dessuten før overføring, så følsomhetstallene fra geler kan ikke overføres direkte.

Deteksjonsgrenser og bakgrunn: der blåfarging kommer til kort

Sammenligningen nedenfor er bevisst omtrentlig. Fargestoffenes ytelse avhenger av gelprosent, båndbredde, optikk og hvor nøye avfargingen utføres. Betrakt hvert tall som en størrelsesorden, ikke en spesifikasjon.

Bakgrunnskontrollen avgjør om det moderate signalet er brukbart. Fritt fargestoff har intens farge, så kontrasten oppstår ved å fjerne ubundet fargestoff uten å fjerne det bundne. Mer konsentrert fargeløsning gir sjelden bedre følsomhet. Det øker først og fremst avfargingstiden. Kjør en fortynningsserie med akkurat den gelen, membranen og det kameraet som skal brukes, og bruk bare området der den integrerte tettheten er proporsjonal med påført mengde. Metylenblått kan brukes til semikvantitativ normalisering av prøvelasting. Det er ikke en kvantitativ analyse med stort dynamisk område, fordi membrankapasitet, overføringseffektivitet, metning og avfarging varierer fra bane til bane.

Kompatibilitetsgrenser: hva tåler fargingen

Kloning etter blåfarging er demonstrert. Flores og kolleger skar ut fargede agarosebånd, isolerte DNA-et og utførte ligering og transformasjon. De rapporterte bedre kloningsresultater enn etter etidiumbromid med UV. Den sannsynlige årsaken er mindre lysskade, ikke en fordel ved selve fargestoffet. Hold eksponeringen for hvitt lys kort, og rens det isolerte DNA-et med vanlig opprensing ved gelekstraksjon.

Dokumentasjonen for PCR og sekvensering er mer begrenset. Gjenværende fargestoff binder nukleinsyrer, så avfarg og rens før enzymatiske trinn. Riktig renset DNA fra en blåfarget gel forventes å fungere, men toleransen for direkte medfølgende fargestoff er ikke godt kvantifisert på tvers av polymeraser og sekvenseringskjemier. Ikke ta den for gitt.

Blothybridisering er kompatibel når rekkefølgen følges strengt: overfør, immobiliser, farg, dokumenter, avfarg, hybridiser. Denne sekvensen er Herrin og Schmidts opplegg. Farging før overføring, eller å hoppe over avfargingen, er en annen metode som krever egen validering. Etter at fargestoffet er fjernet, kan standard fjerning av prober og ny probing gjennomføres som normalt. For farging på cellenivå med samme fargestofffamilie og hvorfor prinsippene for fikserte utstryk ikke kan overføres til metoder for levende celler, se atlaset for mikroskopifarging.

Utskjæring av bånd fungerer for preparativ agarose og for PAGE-oligonukleotider lokalisert med blåfarging, forutsatt at varianten med permanent fiksering unngås. Elektroeluering etter avfarging er kjemisk plausibelt for et reversibelt bindende stoff, men kontrollerte data om utbytte spesifikt for metylenblått er sparsomme. Avsalt eller fell ut etter eluering.

Feil som gjentar seg

Svake gelbånd betyr vanligvis at massen er for liten for kolorimetrisk farging, særlig for korte enkelttrådede mål eller RNA-mål. Påfør mer prøve, bruk fersk fargeløsning, forleng fargingen før du øker konsentrasjonen, og avslutt avfargingen tidligere. En helt blå gel uten kontrast betyr vanligvis overfarging eller for få vannbytter. Blekning av PAGE-bånd er forventet kjemi, ikke mislykket farging. Fotografer raskt. Ujevn membranbakgrunn peker mot folder, bobler, fingeravtrykk, ujevn bevegelse eller flekkvis overføring. Ikke tolk det som ulik prøvelasting uten en hybridiseringskontroll. Et svakt, utsmurt ribosomalt mønster kan bety nedbrytning, men også ufullstendig overføring, for lite totalt RNA (typiske baner inneholder fra flere til titalls mikrogram) eller overdreven avfarging. Fargestoffet viser ribosomalt RNA som forekommer i store mengder. Det viser ikke et bestemt transkript. Den oppgaven tilhører proben.

Sikkerhet og håndtering uten overdrevne påstander

Metylenblått er enklere å håndtere enn etidiumbromid, men det er ikke ufarlig. Et gjeldende sikkerhetsdatablad fra MilliporeSigma klassifiserer fargestoffet som akutt giftig ved svelging, kategori 4, farlig ved svelging, med avhending gjennom en godkjent avfallsordning i henhold til Sigma-Aldrichs sikkerhetsdatablad for metylenblått. Etidiumbromid har strengere advarsler om gentoksisitet, inkludert mistenkte effekter på kjønnsceller i Sigma-Aldrichs sikkerhetsdatablad for etidiumbromid, og geler og løsninger med stoffet sorteres vanligvis separat som farlig kjemisk avfall, som omtalt i Thermo Fishers veiledning for nukleinsyrefargestoffer. Følg sikkerhetsdatabladet og institusjonens regler for begge. Oppbevar tørt fargestoff tørt og tett lukket, gjenbruk arbeidsløsningen bare slik protokollen tillater, oppbevar fargede membraner tørre mellom filterpapirark, og fotografer geler før båndene diffunderer bort.

Husk denne setningen ved laboratoriebenken: Geler tester synlighet ved høy prøvemengde i hvitt lys. Membraner tester overføring og prøvelasting før proben gjør det følsomme arbeidet. Ett fargestoff tjener begge formål, med moderat følsomhet, reversibel binding og en streng rekkefølge på arbeidsoperasjonene.