Hvem utviklet den lilla blodfargingen? Metylenblått, Malachowski, Romanowsky og Giemsa

Eosin er rødt. Metylenblått er blått. Bland de to, påfør blandingen på et tørket blodutstryk, og deler av utstryket blir lilla.

Ikke alle deler. I et godt preparat blir kjernene i hvite blodceller rødlilla, og inne i en malariaparasitt får kromatinet samme farge, mens de omkringliggende røde blodcellene forblir rosa og cytoplasmaet forblir gråblått. Det er den lilla fargen som gjør det mulig å skille celletypene fra hverandre.

Ingen av flaskene inneholder lilla. Fargen oppstår først når et bestemt nedbrytningsprodukt av metylenblått møter eosin på objektglasset, og i 1880- og 1890-årene visste ingen at dette produktet fantes, langt mindre hva det var. De som jaktet på fargen, arbeidet alene med urene fargestoffer, uten noen pålitelig måte å finne ut hva en flaske inneholdt etter at den hadde stått på en hylle i to måneder.

Derfor har spørsmålet i tittelen mer enn ett svar som kan forsvares, og derfor endret svaret seg i 2011.

Et synlig resultat som endret seg med blandingen

Fargingen ble ikke oppfunnet. Den ble til gjennom en rekke bidrag. Hver endring i blandingen ga nøyaktig én ny synlig opplysning, og rekkefølgen på disse opplysningene er den tydeligste måten å forstå historien på.

Mønsteret i den siste kolonnen er det viktige. Hvert fremskritt utvidet fargespekteret, og hver utvidelse gjorde enda en struktur synlig. Den lilla fargen er ikke pynt på teknikken; den utgjør forskjellen mellom å se at en parasitt er til stede og å se hva den består av. Hvordan selve fargestoffet fant veien fra en BASF-fargestoffabrikk til medisinen, er en lengre historie med egne dokumenter. Hele forløpet ovenfor, med kilden bak hver oppføring, finnes i en tidslinje over bidragsyterne med kildehenvisninger.

Figur: De samme seks blandingene fremstilt som det som var i skålen, og det som kom ut av den. Sirklene viser fargestoffene; blokkene under viser fargene disse fargestoffene kunne frembringe i et blodutstryk. Ingen blanding før 1890 har en rødlilla blokk, og ingen etterpå mangler den.

Mannen som brukte boraks med hensikt

Ernst Malachowski var lege i Breslau, dagens Wrocław. Han tilbrakte yrkeslivet i privat praksis og i en liten klinikk han drev sammen med en kollega, og gjorde laboratoriearbeid på fritiden. Han ble født i Strzelno 12. mars 1857, studerte medisin ved Universitetet i Breslau og arbeidet fra 1882 til 1887 som assistent i indremedisin ved Allehelgenshospitalet, som den gang var det nest største sykehuset i Tyskland.

Han begynte i 1888 med Chęcińskis og Plehns dobbeltfarging. I et preparat laget i 1889 så han at kromatinet i plasmodiekjernen ble farget annerledes enn cytoplasmaet, men oppdaget så at han ikke kunne gjenskape resultatet. Han prøvde å gjøre metylenblåttet surt, noe som gjorde resultatet dårligere. Han prøvde å gjøre det alkalisk med boraks, og det virket hver gang. Han demonstrerte metoden offentlig 15. juni 1890 og publiserte en mer utførlig beskrivelse i august 1891, inkludert instruksjonen om boraks. Han bemerket at fargingen tok tjuefire timer, og at resultatene var enkle å gjenskape.

Tjuefire timer er lang tid i et diagnostisk laboratorium, og artikkelen hans gikk ikke nærmere inn på den lilla-røde fargen i parasittkjernen. Uansett årsak tok ingen i bruk bevisst alkalisering av metylenblått før Nocht gjorde det igjen i 1898. Malachowski skrev aldri mer om blodfarging.

Grunnen til at så lite var kjent om ham inntil nylig, ligger i arkivene og er ikke noe mysterium. Nesten ingen spor etter livet hans overlevde i den medisinske litteraturen, og det som overlevde, kom gjennom én kanal. Datteren Marie forlot Tyskland og dro til London i 1939, tjenestegjorde i den britiske hæren og bosatte seg i Canada. Samlingen hennes av familiepapirer endte ved Leo Baeck Institute i New York. Broren Leo ble drept i første verdenskrig. Søsteren Eva ble deportert fra Breslau til transittleiren Izbica i april 1942 og kom aldri tilbake. Moren Hedwig tok sitt eget liv 22. april 1942 fremfor å vente på den samme deportasjonen. Malachowski hadde dødd i 1934, før alt dette.

En familiehistorie som ender slik, er en familiehistorie som slutter å bli sitert. De to artiklene som ga Malachowski plassen tilbake i fargingens utviklingshistorie, begge publisert i 2011, ble utarbeidet på grunnlag av arkivdokumenter i Poznań og Wrocław og Maries papirer i New York.

En muggen flaske og en heldig russer

Dmitri Romanowsky studerte medisin ved Det militærmedisinske akademiet i St. Petersburg og arbeidet med malaria gjennom det meste av yrkeslivet. I 1890 publiserte han en metode som på papiret var nesten identisk med Chęcińskis: uendret metylenblått og eosin, med litt mer eosin.

I september 1891 publiserte han metoden som gjorde navnet hans kjent, og den avgjørende detaljen var gjemt i instruksjonene. De beste resultatene hans kom fra den lagrede metylenblåttløsningen, en stamløsning av metylenblått som hadde stått i over to måneder med muggvekst. Muggen og tiden løsningen hadde stått, hadde delvis demetylert fargestoffet. Romanowsky visste ikke dette og kunne ikke kontrollere det, og andre som prøvde metoden hans, fikk ikke frem den lilla fargen. Avhandlingen hans var levert i St. Petersburg i juni 1891, og derfor regnes 1891 som oppdagelsesåret i den vanlige fremstillingen.

Malachowskis demonstrasjon hadde funnet sted i juni 1890, over ett år tidligere, og metoden hans virket som tilsiktet.

Hvorfor metoden fikk navn etter feil mann

Argumentasjonen for Malachowski ble utarbeidet av Kristine Krafts, Ernst Hempelmann og Barbara Oleksyn og bygger på fire forhold. Datoen for den offentlige demonstrasjonen: juni 1890 mot september 1891. Ordet bevisst mot ordet tilfeldig. Det at Malachowski publiserte metoden sin, med boraks og alt, mens Romanowskys metode var avhengig av en ukontrollert variabel. Og observasjonen av at beskrivelsen av plasmodiekjernen, sammen med den lilla fargen som gjorde den synlig, i praksis forsvant fra litteraturen i sju år fordi ingen kunne gjenskape den tilfeldige varianten.

De er tydelige i konklusjonen. I den biografiske artikkelen kaller de krediteringen «en parodi», og de siterer Ralph Lillie, som i 1978 skrev at «kanskje vi burde omtale denne familien av fargemetoder som Malachowski-farginger».

Påstanden er omstridt, slik påstander om hvem som var først vanligvis er, og det er verdt å forklare hva uenigheten dreier seg om fremfor å avgjøre den. En diskusjon om hvem som var først, må definere hva oppdagelsen var. Hvis oppdagelsen er den lilla fargen, har Malachowski den tidligste dokumenterte demonstrasjonen. Hvis oppdagelsen er den publiserte metoden, publiserte begge i 1891, og metoden fikk navn etter Romanowsky. Hvis oppdagelsen er forklaringen, kan ingen av dem gjøre krav på den, fordi ingen av dem visste at modning var demetylering, og ingen kunne si hvorfor fargen i det hele tatt oppsto. Det siste punktet er det populærfremstillinger hopper over. Den aktive bestanddelen var en urenhet ingen hadde identifisert, og den første som frembrakte fargen bevisst, gjorde det med en reproduserbar, empirisk oppskrift, ikke ut fra en forståelse av hva oppskriften gjorde.

De to artiklene fra 2011 er den mest utførlige publiserte argumentasjonen for Malachowski, og begge kan leses gratis via PubMed: den lange oversiktsartikkelen på PMID 21235291 og den biografiske artikkelen på PMID 21660627. PubMed-oppføringen for oversiktsartikkelen viser også en kommentar til den, publisert i samme tidsskrift senere samme år på 86(5):366. Det er en nyttig påminnelse om at argumentasjonen ble utfordret på trykk så snart den kom ut.

Striden handler ikke om uenighet om kjemien. Alle involverte er enige om hva den lilla fargen er, og hvilke komponenter som frembringer den. Uenigheten handler om hvem som kom dit først, og om et tilfeldig resultat som ingen kunne gjenta, i det hele tatt teller som å ha kommet dit.

Hva de senere navnene bidro med

Hvis Malachowski frembrakte den lilla fargen først, hvorfor bærer fargingen navnene til Romanowsky, Wright og Giemsa?

Fordi en farging som virker én gang i oppfinnerens hender, ikke er en reagens. Det senere arbeidet gjorde en uberegnelig blanding til noe en tekniker i et annet land kunne bruke på en tirsdag.

Nocht kom frem til løsningen ved å resonnere. Etter å ha mislyktes med å få et pålitelig resultat fra et enkelt nøytralt fargestoff, konkluderte han med at den lilla fargen måtte komme fra noe i metylenblåttet som ikke var metylenblått, og begynte å lete etter det. Unna hadde allerede lagt merke til at gamle metylenblåttløsninger farget mastcellegranula røde, og foreslo at et nytt stoff ble dannet når fargestoffet modnet. Bernthsen hadde vist i 1885 at alkaliske forhold fjerner metylgrupper fra metylenblått, og at disse produktene er det vi nå kaller azurfargestoffene. Nocht ekstraherte den aktive fraksjonen med kloroform og kunne bare kalle den rødt fra metylenblått; Michaelis ga den navnet azur I i 1901. Jenner løste logistikken. Ved å løse opp bunnfallet av metylenblått og eosin på nytt i absolutt metanol fikk han én stabil løsning som fikserte utstryket mens det ble farget, og gjorde varmefiksering overflødig. Leishman og Reuter kombinerte polykromert fargestoff med et alkoholbasert løsemiddel og oppnådde både stabilitet og den lilla fargen. Wright erstattet en tolv timers inkubasjon ved 65 °C og ti dagers henstand med én time i strømmende damp. Giemsa sluttet helt å basere seg på en tilfeldig modnet løsning og brukte oppmålte mengder av kjente fargestoffer med glyserol i metanolen, slik at produktet tålte tropisk varme. Han publiserte aldri hvordan han laget rent metylenazur. Han solgte det til Dr. Grüblers laboratorium i Leipzig, som markedsførte det som azur I og hevdet at bare deres versjon var ekte Giemsa-farging.

Identiteten til dette azurfargestoffet diskuteres fortsatt. Noen mener at det ganske enkelt var polykromert metylenblått, andre at det var rikt på azure B. Svaret kom som følge av en krig. Da tyske fargestoffer ikke lenger kunne skaffes, fant et team fra United States Public Health Service, Ralph Lillie sammen med Maurice Roe og Aimee Wilcox, at den beste fargingen kom fra tre atskilte komponenter: uendret metylenblått, dets demetylerte nedbrytningsprodukt azure B og eosin. Azure B erstattet azur I, som ikke var tilgjengelig, og disse tre komponentene er fortsatt grunnlaget for fargingen som brukes til å diagnostisere malaria i dag.

Kjemien bak hvordan disse tre komponentene samvirker på et objektglass, er et eget spørsmål og tema for en annen side. Fargestoffenes roller og kjemien i Romanowsky-type farginger beskriver hva azure B og eosin gjør hver for seg, og hvorfor de sammen frembringer en farge som ingen av dem gir alene. Siden om mikroskopi og laboratoriebruk tar for seg den praktiske siden: hva et gitt preparat viser, og hvordan man vurderer om et bestemt produkt er egnet for metoden man vil bruke.

Den delen av historien som fortsatt er aktuell

Én detalj i denne historien sluttet ikke å være sann i 1902. I omtrent femti år var den viktigste komponenten i verdens standardfarging for malaria en urenhet uten navn. Den var der ved en tilfeldighet, mengden varierte mellom flasker, identiteten var en forretningshemmelighet i deler av perioden, og andelen ble diskutert helt frem til 1940-årene. De som brukte fargingen, var ikke uforsiktige. De hadde ingen mulighet til å vite hva flasken inneholdt.

Den moderne varianten av det samme problemet er en spesifikasjon som bare beskriver deler av materialet. Samsvar med USP er veien til den høyeste renheten markedet tilbyr, fordi det er en fullstendig publisert standard snarere enn én enkelt måling: identitet, renhet, organiske urenheter inkludert azurfargestoffene, rester av løsemidler, elementære urenheter, gløderest, mikrobiologiske grenseverdier og bakterielle endotoksiner. Blupreme skaffer metylenblåttet sitt fra en farmasøytisk produsent og publiserer det fullstendige analysesertifikatet, slik at hvert punkt i denne listen kan kontrolleres fremfor bare å påstås. Et sertifikat som oppgir et resultat for tungmetaller og kaller det samsvar med USP, er dagens motstykke til en flaske merket «modnet metylenblått»: muligens en utmerket reagens, men etiketten forteller ikke hva den inneholder.