Avlesning av E. coli og andre koloniutseender på EMB-agar

En student stryker ut en ukjent prøve på eosin-metylenblått-agar, inkuberer den over natten og kommer tilbake til en plate med mørke kolonier med grønn glans. I laboratorieboken står det «E. coli, bekreftet». Den noteringen hevder mer enn platen gir grunnlag for. Platen viser en vekst- og fermenteringsfenotype under bestemte betingelser. Artsidentitet er en egen konklusjon som krever egne holdepunkter.

Denne veiledningen behandler resultater på EMB-agar som en tolkningsoppgave. Den forklarer prinsippet bak, går gjennom et illustrerende plateatlas med kontroller og beskriver tilfellene der lærebokbildet er misvisende.

Prinsippet bak platen

EMB-agar er både selektiv og differensierende. Fargestoffene eosin Y og metylenblått hemmer mange grampositive organismer, slik at mediet favoriserer gramnegativ vekst. De samme fargestoffene fungerer som indikatorer: Når en organisme fermenterer det tilgjengelige sukkeret og produserer tilstrekkelig syre lokalt, tar kolonien opp mye fargestoff og blir mørklilla til blåsvart. Ved kraftig syreproduksjon kan kolonioverflaten vise en metallisk grønn irisering. ASM-protokollen for eosin-metylenblått-agarplater beskriver denne kombinasjonen av seleksjon og differensiering og inneholder referansefotografier til undervisning.

Én detalj er viktig før et resultat avleses: Sjekk hvilken formulering som brukes. Den eldre Holt Harris Teague-formuleringen inneholder både laktose og sukrose, mens Levine EMB bare inneholder laktose. En organisme som fermenterer sukrose, men ikke laktose, slik som mange Serratia marcescens-isolater, kan se forskjellig ut på de to variantene. Produsentens dokumentasjon for EMB-medier angir denne forskjellen i formulering uttrykkelig. Noter produsent og formulering i laboratorieboken sammen med resultatet.

Ferdig tilberedt, uinokulert EMB-agar er vanligvis rødbrun til rødlilla, noen ganger med et grønnlig skjær eller et fint bunnfall. Denne bakgrunnsfargen er ikke vekst. Sammenlign hver avlesning med en uinokulert plate eller det dokumenterte utgangspunktet, og avles primærplaten etter omtrent 18 til 24 timers aerob inkubasjon ved 35 til 37 C, med mindre undervisningsprotokollen angir noe annet. Lengre inkubasjon kan endre hvordan fermenteringen kommer til uttrykk.

Slik undersøker du platen

Bruk to typer lys. Undersøk først platen i reflektert eller skrått innfallende lys, og vipp den: Metallglansen er iriserende og kan komme til syne eller forsvinne med betraktningsvinkelen. Undersøk den deretter i gjennomfallende lys for å vurdere kolonifarge og mørke sentre. Ta utgangspunkt i godt isolerte kolonier, siden tett vekst og nabokolonier endrer den lokale syreopphopningen og kan dempe eller forsterke fargen. ASMs bildesamling viser dette direkte: E. coli i blandingskultur kan miste den forventede glansen fordi omkringliggende organismer endrer det lokale syremiljøet.

Ta med kontroller når øvelsen tillater det. Et vanlig kontrollsett i undervisningen er E. coli ATCC 25922 for fenotypen med blåsvart farge og metallglans, en ikke-fermenterende bakterie som Salmonella Typhimurium ATCC 14028 eller Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 for den fargeløse fenotypen, og en grampositiv bakterie som Enterococcus faecalis eller Staphylococcus aureus som hemmingskontroll, slik det er angitt i standardtabeller for kvalitetskontroll av EMB-medier. Hvis den positive kontrollen mangler glans, bør du mistenke inkubasjon, tett vekst eller formulering før du mistenker den ukjente prøven.

Illustrerende plateatlas

Platene nedenfor er genererte illustrasjoner, ikke fotografier av virkelige kulturer. De viser mønsteret du skal se etter, ikke den nøyaktige fargenyansen til en bestemt stamme. Sammenlign dem med ASMs referansefotografier og med virkelige plater fra undervisningslaboratoriet.

Plate 1: Escherichia coli på EMB-agar, kraftig laktosefermentering

E. coli på EMB-agar er vanligvis mørklilla til blåsvart, ofte med et mørkt sentrum og metallisk grønn glans som følge av kraftig syreproduksjon. Glansen er det velkjente funnet studentene leter etter, men bør behandles som et støttende holdepunkt, ikke som en definisjon. Glansens intensitet varierer med stamme, inkubasjonstid, kolonitetthet og betraktningsvinkel. Fravær av glans utelukker ikke E. coli, og en mørk koloni uten glans peker mot flere andre fermenterende bakterier. Velg en godt isolert koloni til videre arbeid i stedet for å avlese et område med tett vekst.

Plate 2: Klebsiella pneumoniae på EMB-agar, slimete fermenterende bakterie

Klebsiella pneumoniae på EMB-agar danner vanligvis store, skinnende, slimete kolonier i rosa-lilla til brunlilla nyanser, ofte med mørke sentre, men vanligvis uten sterk metallglans. Lignende morfologi forekommer hos beslektede fermenterende bakterier som Enterobacter. Slimete konsistens og kolonistørrelse inngår i avlesningen: En liten og flat rosa koloni har en annen tolkningsverdi enn en stor, hvelvet og slimete koloni. Som med E. coli antyder platen en fermenteringsfenotype, og navngivning på artsnivå krever biokjemisk bekreftelse som beskrevet nedenfor.

Plate 3: Salmonella på EMB-agar og andre ikke-fermenterende bakterier, fargeløse kolonier

Salmonella på EMB-agar og beslektede bakterier som ikke fermenterer laktose, blant annet Shigella og mange Pseudomonas-isolater, vokser vanligvis som fargeløse til gjennomskinnelige eller blekt ravfargede kolonier. Enkelte formuleringer og betingelser gir et svakt rosa skjær, så en blekrosa koloni er ikke automatisk en fermenterende bakterie. EMB skiller ikke Salmonella fra Shigella eller fra andre ikke-fermenterende bakterier; dette skillet må gjøres med senere tester. Merk også at laktosepositive Salmonella-stammer med E. coli-lignende metallglinsende kolonier er dokumentert, noe som er enda en grunn til at én enkelt plate ikke kan avgjøre saken.

Plate 4: Serratia marcescens og formuleringsfellen

Serratia marcescens fortjener en egen seksjon fordi studenter ofte forventer røde kolonier og dermed feiltolker platen. De fleste kliniske isolater fermenterer ikke laktose, så på Levine EMB fremstår de vanligvis som bleke til svakt fargede. Fordi mange isolater fermenterer sukrose, kan en sukroseholdig formulering gi en mørkere eller mer syrepreget reaksjon. Forvent heller ikke det klassiske røde prodigiosinpigmentet ved 35 til 37 C; pigmentproduksjonen er upålitelig ved inkubatortemperatur. Når protokollen omtaler Serratia marcescens på EMB-agar, må du sjekke hvilken formulering utsagnet forutsetter. En oversiktsartikkel om Serratias metabolisme oppsummerer mønsteret med negativ laktosefermentering og variabel sukrosefermentering som ligger bak denne fellen.

Plate 5: kontroller og hemmede organismer

Grampositive organismer som Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus og Bacillus hemmes vanligvis eller får kraftig redusert vekst på EMB-agar, selv om hemmingen ikke er absolutt for alle stammer. Et kontrollpanel gjør avlesningen etterprøvbar: E. coli-kontrollen skal vise god vekst med blåsvart farge og glans, kontrollen med en ikke-fermenterende bakterie skal vise fargeløs vekst, og hemmingskontrollen skal vise liten eller ingen vekst. Hvis hemmingskontrollen vokser godt, har det selektive trinnet sviktet, og alle andre avlesninger fra det partiet er tvilsomme. Fargemetoder besvarer et annet spørsmål enn dyrkningsmedier; for farging av objektglass i laboratoriet, se atlaset for farging med metylenblått.

Sammenligning med tydelige begrensninger

Tre setninger oppsummerer de misvisende utseendene. Mørk farge betyr ikke E. coli, siden Klebsiella, Enterobacter og andre fermenterende bakterier utvikler mørke sentre uten glans. Rosa betyr ikke Klebsiella, siden bakterier med moderat eller langsom fermentering og enkelte bakterier som regnes som ikke-fermenterende, fremstår som rosa eller lavendelfargede. Glans betyr ikke at E. coli er endelig påvist, siden andre kraftig fermenterende bakterier kan produsere den. Undervisningsprotokollen og figurene med blandingskulturer illustrerer hver av disse feiltolkningene.

Begrensninger ved bekreftelse

EMB-agar viser en fenotype, ikke en art. Ulike organismer kan ha samme koloniutseende, og én organisme kan avvike fra lærebokbildet avhengig av stamme, alder, tett vekst, formulering og inkubasjon. Derfor brukes EMB-morfologi som en foreløpig indikasjon både i undervisning og i kliniske arbeidsprosesser.

En faglig forsvarlig arbeidsflyt for studenter er å beskrive den isolerte kolonien (størrelse, farge, sentrum, glans i skrått innfallende lys, slimete preg) og registrere formulering, inkubasjonstid og temperatur samt kontroller; deretter rendyrkes en godt isolert koloni ved subkultur før noen bekreftende test. Vanlige oppfølgingsundersøkelser omfatter gramfarging og IMViC-reaksjoner for foreløpig identifikasjon av E. coli og koliforme bakterier, TSI eller KIA og organismespesifikke biokjemiske testpaneler for enteriske organismer, med serologisk identifikasjon, MALDI TOF eller annen validert identifikasjon der oppgaven krever det. For bakgrunn om hvordan EMB passer inn blant selektive og differensierende medier for enteriske bakterier, se innføringer i dyrkningsmedier for enteriske bakterier og oppfølging med gramfarging. Når det gjelder det beslektede spørsmålet om hva blåfarging av et preparat kan og ikke kan bevise, holder atlaset for farging med metylenblått observasjon og konklusjon adskilt på samme måte.

Skriv observasjonen før konklusjonen. «Mørke blåsvartfargede kolonier med vinkelavhengig grønn glans på Levine EMB etter 24 timer, forenlig med kraftig laktosefermentering» er faglig forsvarlig. «E. coli, bekreftet» krever det bekreftelsestrinnet som platen alene ikke kan gi.