Microscopy အတွက် methylene blue အစားထိုးများ: လုပ်ငန်းအလိုက် ရွေးချယ်ပါ

ရိုးရှင်းသော ဘက်တီးရီးယား smear တစ်ခုတွင် ဆဲလ်ပုံသဏ္ဌာန်ကို မြင်ရန် ရည်ရွယ်ပါက crystal violet ကို methylene blue အစား အသုံးပြုနိုင်သည်။ အသက်ရှင်နေသော ဆဲလ်များအတွက်မူ stain လုံးဝမသုံးသော phase contrast က ပိုသင့်လျော်သည့် အစားထိုးနည်း ဖြစ်နိုင်သည်။ ရွေးချယ်မှုသည် သင်ပြုလုပ်လိုသည့် လေ့လာမှုအပေါ် မူတည်သည်။

လူနှစ်ဦးက တူညီသော ဘက်တီးရီးယား culture ကို စစ်ဆေးနေသည်ဟု ယူဆပါ။ တစ်ဦးက rod ပုံစံ ဆဲလ်များနှင့် ဝိုင်းသော ဆဲလ်များကို ခွဲခြားလိုသည်။ နောက်တစ်ဦးက treatment တစ်ခုကြောင့် ဘက်တီးရီးယားများ သေဆုံးသွားခြင်းရှိမရှိ သိလိုသည်။ ပထမလူအတွက် ရှင်းလင်းသော ပုံရိပ်ပေးသော stain တစ်မျိုးသည် ဒုတိယလူအတွက် အသုံးဝင်သော အဖြေ မပေးနိုင်ပါ။

အစားထိုးနည်း မရွေးမီ ဤဝါကျကို ပြည့်စုံအောင် ဖြည့်ပါ: “ကျွန်ုပ်သည် ___ ထဲတွင် ___ ကို လေ့လာရန် လိုအပ်ပြီး၊ ဆဲလ်များသည် အသက်ရှင်နေရမည် / အသက်ရှင်နေရန် မလိုပါ။” ဤဝါကျက stain ဖြည့်ဆည်းရမည့် လုပ်ငန်းကို သတ်မှတ်ပေးသည်။

နမူနာနှင့် မေးခွန်းမှ စတင်ပါ

ပထမဦးစွာ ဆဲလ်များ အသက်ရှင်နေရန် လိုအပ်ခြင်းရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ပြီးနောက် သင်လေ့လာလိုသည့် အင်္ဂါရပ်ကို သတ်မှတ်ပါ:

• ဆဲလ်များ အသက်ရှင်နေရမည်: လှုပ်ရှားမှု သို့မဟုတ် ပုံသဏ္ဌာန်အတွက် stain မသုံးသော phase contrast သို့မဟုတ် DIC ကို စဉ်းစားပါ; nuclear DNA အတွက် fluorescence နှင့် Hoechst 33342 ကို စဉ်းစားပါ; membrane integrity အတွက် SYTO 9 နှင့် propidium iodide ကဲ့သို့ အတည်ပြုထားသော assay ကို ရွေးချယ်ပါ။
• ဆဲလ်များ အသက်ရှင်နေရန် မလိုပါ: ဘက်တီးရီးယား morphology အတွက် crystal-violet simple stain သို့မဟုတ် nigrosin negative stain ကို စဉ်းစားပါ; Gram reaction အတွက် ပြည့်စုံသော Gram-stain method ကို အသုံးပြုပါ; fixed cells များရှိ nuclear DNA အတွက် DAPI fluorescence ကို စဉ်းစားပါ။ ဌာနခွဲတစ်ခုချင်းစီ၏ ကန့်သတ်ချက်များကို နှိုင်းယှဉ်ရန် ဤဇယားကို အသုံးပြုပါ။ ဤအရာများသည် နည်းလမ်းရွေးချယ်မှုများဖြစ်ပြီး ရှိပြီးသား protocol တစ်ခုအတွင်း reagent bottle များကို အစားထိုးရန် ညွှန်ကြားချက်များ မဟုတ်ပါ။

ရိုးရှင်းသော smear အတွက် နည်းလမ်းကို သတိထား၍ အစားထိုးပါ

လုပ်ငန်းသည် ဘက်တီးရီးယား morphology ကို အရောင်တစ်မျိုးတည်းဖြင့် ကြည့်ရန်ဖြစ်ပါက crystal violet သည် လက်တွေ့ကျသော ရွေးချယ်စရာတစ်ခု ဖြစ်သည်။ FDA ၏ Bacteriological Analytical Manual တွင် simple staining အတွက် သင့်လျော်သော crystal-violet formulation နှစ်မျိုး ကို ဖော်ပြထားသည်။ မှတ်တမ်းတင်ထားသော formulation နှင့် ၎င်း၏ preparation method ကို အသုံးပြုပါ; dye ၏အမည်တစ်ခုတည်းက အသုံးပြုရန် အသင့်ဖြစ်သော reagent ကို မသတ်မှတ်ပေးနိုင်ပါ။

Crystal violet ကို Gram staining တွင်လည်း အသုံးပြုသော်လည်း crystal-violet simple stain တစ်ခုကို Gram stain ဖြစ်စေသည်ဟု မဆိုလိုပါ။ ASM Gram-stain protocol တွင် differential result သည် crystal violet၊ iodine၊ decolorization နှင့် counterstaining တို့ အစဉ်လိုက် လုပ်ဆောင်မှုအပေါ် မူတည်သည်။ ထိုအဆင့်များကို ချန်လှပ်ပါက ပုံရိပ်မှ သတ်မှတ်နိုင်သည့် အချက်များ ပြောင်းလဲသွားသည်။ ဤကွာခြားချက်အတွက် simple staining နှင့် Gram staining နှိုင်းယှဉ်ချက် ကို ကြည့်ပါ။

Nigrosin သည် outline များကို ဖော်ပြရန် မတူညီသော နည်းလမ်းတစ်ခု ပေးသည်: ၎င်းက နောက်ခံကို မှောင်စေပြီး ဘက်တီးရီးယားဆဲလ်များကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်လျှင် ပိုလင်းနေစေသည်။ Merck ၏ nigrosin ညွှန်ကြားချက်များ တွင် ယေဘုယျ အစားထိုးစာရင်းတစ်ခုက လွတ်သွားနိုင်သည့် အသုံးဝင်သော အသေးစိတ်တစ်ခု ရှိသည်။ ၎င်း၏ သတ်မှတ်ထားသော working formulation တွင် formaldehyde ပါဝင်သည်။ ထို့ကြောင့် ဆဲလ်များကိုယ်တိုင် stain မစွန်းထားသကဲ့သို့ မြင်ရသော်လည်း “negative stain” ဟူသော စကားလုံးများမှ live-cell compatibility ကို ကောက်ချက်ချ၍ မရပါ။ Formulation အပြည့်အစုံနှင့် specimen preparation ကို စစ်ဆေးပါ။

အသက်ရှင်သော နမူနာများအတွက် optics ကို ပြောင်းလဲစဉ်းစားပါ

ဆဲလ်များ လှုပ်ရှားခြင်း သို့မဟုတ် ခွဲခြားပွားများခြင်းကို ကြည့်လိုပါက dye တစ်မျိုး ထပ်ထည့်ခြင်းက လေ့လာမှုကို ပိုမိုရှုပ်ထွေးစေနိုင်သည်။ Nikon ၏ transparent specimens များရှိ contrast လမ်းညွှန်တွင် ရှင်းပြထားသကဲ့သို့ phase contrast နှင့် differential interference contrast သို့မဟုတ် DIC တို့သည် နမူနာများ၏ optical properties ကွာခြားချက်များမှတစ်ဆင့် ၎င်းတို့ကို မြင်နိုင်စေသည်။ Microscope တွင် လိုအပ်သော components များရှိပါက အသက်ရှင်ပြီး stain မစွန်းထားသော ဆဲလ်များကို ဖော်ပြနိုင်သည်။

ဤရွေးချယ်မှုသည် stain မစွန်းထားသော preparation ကို ထိန်းသိမ်းပေးသော်လည်း ရရှိနိုင်သည့် အချက်အလက်ကို ပြောင်းလဲစေသည်။ မည်သည့် molecule က contrast ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်ကို မသိဘဲ boundary သို့မဟုတ် လှုပ်ရှားမှုကို လိုက်ကြည့်နိုင်သည်။ မေးခွန်းက molecular localization ဖြစ်ပါက သင့်လျော်သော labeling method ကို ရွေးချယ်ပါ။

Nuclear DNA အတွက် Invitrogen ၏ DAPI နှင့် Hoechst stains နှိုင်းယှဉ်ချက် သည် DAPI ကို fixed cells များတွင် အများအားဖြင့် အသုံးပြုခြင်းနှင့် ဆဲလ်အတွင်း ပိုမိုဝင်ရောက်နိုင်သော Hoechst 33342 ကို live-cell labeling အတွက် ပိုမိုရွေးချယ်အသုံးပြုခြင်းတို့ကို ခွဲခြားဖော်ပြထားသည်။ နှစ်မျိုးစလုံးတွင် fluorescence equipment လိုအပ်သည်။ နှစ်မျိုးစလုံးသည် အရောင်ရှိသော brightfield stain ကို တိုက်ရိုက်အစားထိုးခြင်း မဟုတ်ပါ။

Dye exposure နှင့် illumination ကို စမ်းသပ်မှုအခြေအနေများအဖြစ် သတ်မှတ်ပါ။ ဆဲလ်များ၏ အပြုအမူကို တိုင်းတာနေပါက stain စွန်းထားသော preparation နှင့် stain မစွန်းထားသော preparation တို့ကို နှိုင်းယှဉ်ပါ။

အနီရောင်ဆဲလ်သည် အလိုအလျောက် သေဆုံးသောဆဲလ် မဟုတ်ပါ

SYTO 9 နှင့် propidium iodide ကို ဘက်တီးရီးယား membrane integrity အကဲဖြတ်ရန် မကြာခဏ တွဲဖက်အသုံးပြုသည်။ BacLight manual တွင် intact membranes ကို အစိမ်းရောင် staining နှင့် damaged membranes ကို အနီရောင် staining နှင့် ဆက်စပ်ဖော်ပြထားသည်။ ထိုအဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုချက်ကို နမူနာအတွက် အတည်ပြုရန် လိုအပ်သည်။

Rosenberg နှင့် လုပ်ဖော်ကိုင်ဖက်များ၏ 2019 လေ့လာမှု က ပြဿနာကို ဖော်ပြပေးသည်။ Phosphate-buffered saline ထဲတွင် glass ပေါ်၌ 24-hour E. coli biofilms များကို လေ့လာရာတွင် ဆဲလ်များ၏ 96% ခန့်သည် in situ တွင် propidium-iodide-positive အဖြစ် ပေါ်လာခဲ့သည်။ သို့သော် နမူနာများကို ရယူပြီးနောက် 82% သည် cultivable ဖြစ်ကြောင်း သုတေသီများက ခန့်မှန်းခဲ့သည်။ Confocal images များတွင် အနီရောင် stain စွန်းထားသော material အောက်၌ အစိမ်းရောင် အတွင်းပိုင်းရှိ ဆဲလ်များကို တွေ့ရပြီး extracellular nucleic acids များကြောင့် အထင်မှားစေသော signal ဖြစ်ပေါ်နိုင်ကြောင်း ညွှန်ပြခဲ့သည်။

ထိုရာခိုင်နှုန်းများသည် လေ့လာမှုတွင် အသုံးပြုထားသော preparations များအပေါ် မတူညီသော တိုင်းတာမှုများကို ဖော်ပြခြင်းဖြစ်ပြီး နေရာတိုင်းအတွက် သုံးနိုင်သော correction factor မဟုတ်ပါ။ အသုံးဝင်သော သင်ခန်းစာမှာ signal ကို မည်သည့်အရာက ဖြစ်ပေါ်စေသည်ကို စစ်ဆေးရန်ဖြစ်သည်။ Biofilm တစ်ခုတွင် nucleic-acid dye သည် damaged cells အတွင်းရှိ material သာမက ဆဲလ်ပြင်ပရှိ material ကိုပါ တွေ့ရှိနိုင်သည်။ Viability ဆိုင်ရာ ကောက်ချက်ချရန် သုတေသီများက cultivation သို့မဟုတ် metabolic activity ကဲ့သို့ ဖြည့်စွက်တိုင်းတာမှုများကို အကြံပြုထားပြီး နည်းလမ်းတစ်ခုချင်းစီတွင် ကန့်သတ်ချက်များရှိကြောင်းလည်း အသိအမှတ်ပြုထားသည်။

အစားထိုးနည်းတွင် အမှန်တကယ် ဘာပါဝင်သည်ကို စစ်ဆေးပါ

အစားထိုး staining method တစ်ခုတွင် methylene blue ပါဝင်နေသေးနိုင်သည်။ Giemsa သည် ဥပမာတစ်ခုဖြစ်သည်: Merck က ၎င်း၏ product ကို blood နှင့် bone-marrow smears အပါအဝင် အသုံးပြုမှုများအတွက် ရည်ရွယ်ထားသော azure-eosin-methylene-blue solution အဖြစ် ဖော်ပြထားသည်။ ၎င်းသည် မတူညီသော specimen အတွက် မတူညီသော method တစ်ခု ဖြစ်နိုင်သော်လည်း methylene blue ကို လုံးဝမပါဝင်စေရန် လိုအပ်ချက်ကို မဖြည့်ဆည်းနိုင်ပါ။

Compound တစ်မျိုးကို ချန်လှပ်ခြင်းသည် စမ်းသပ်မှု၏ အစိတ်အပိုင်းဖြစ်ပါက ပုံရိပ်များကို မနှိုင်းယှဉ်မီ reagent identity နှင့် formulation ကို စစ်ဆေးပါ။ methyl blue၊ methylene blue နှင့် အမည်ဆင်တူသော dyes များ ဆိုင်ရာ လမ်းညွှန်တွင် အမည်ကွာခြားချက်များကို ရှင်းပြထားသည်။

ရလဒ်ကို အသုံးမပြုမီ အစားထိုးနည်းကို အတည်ပြုပါ

နည်းလမ်းအသစ်တစ်ခုအတွက် ကိုယ်စားပြုနမူနာများနှင့် သင့်လျော်သော control ကို အသုံးပြုပြီး အသေးစား နှိုင်းယှဉ်မှုတစ်ခု ပြုလုပ်ပါ။ ဖြစ်နိုင်သည့်နေရာတွင် microscope settings များကို နှိုင်းယှဉ်နိုင်သည့် အခြေအနေတွင် ထားပါ။ ပိုကြည့်ကောင်းသော ပုံရိပ်ကို အကြောင်းရင်း စုံစမ်းနိုင်ရန် reagent formulation၊ specimen preparation၊ exposure နှင့် imaging conditions တို့ကို မှတ်တမ်းတင်ပါ; ပုံရိပ်ကြည့်ကောင်းခြင်းတစ်ခုတည်းဖြင့် ရွေးချယ်ခြင်း မပြုပါနှင့်။

အောင်မြင်မှုကို မူလမေးခွန်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ အကဲဖြတ်ပါ။ Morphology အတွက် ဆဲလ်အနားသတ်များနှင့် arrangement ကို အဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုနိုင်သေးခြင်းရှိမရှိ စစ်ဆေးပါ။ Nuclear labeling အတွက် signal location နှင့် background ကို စစ်ဆေးပါ။ Viability အတွက် ကြည့်ကောင်းသော အရောင်ခွဲခြားမှုတစ်ခုထက် ပိုသော အထောက်အထားကို လိုအပ်ပါသည်။ ပိုမိုကျယ်ပြန့်သော methylene blue staining နှင့် laboratory applications လမ်းညွှန် တွင် observation နှင့် preparation တို့ မည်သို့ ဆက်စပ်သည်ကို ရှင်းပြထားသည်။

သင်လိုအပ်သော တိုင်းတာမှုကို ထိန်းသိမ်းပေးနိုင်သည့် အစားထိုးနည်းကို ရွေးချယ်ပါ။ အရောင်သည် ရရှိလာသော ပုံရိပ်၏ ဂုဏ်သတ္တိများထဲမှ တစ်ခုသာ ဖြစ်သည်။