L-Artikolu
Jista’ l-blu tal-metilen jevita l-Kumpless III mitokondrijali? Għaliex l-istudji ma jaqblux
Żewġ laboratorji staqsew jekk il-blu tal-metilen jistax jevita Kumpless III mitokondrijali mblukkat. Wieħed wieġeb le. L-ieħor wieġeb iva. It-tnejn kellhom id-data.
L-ewwel studju, fuq mitokondriji tal-moħħ tal-ġrieden, sab li ż-żebgħa ma tistax tagħmel dan. It-tieni, fuq mitokondriji tal-moħħ minn tliet speċijiet ta’ annimali gerriema, sab li tista’ parzjalment. It-tielet studju, fuq il-fwied tal-ġrieden, spiss jiġi ċċitat fl-istess kuntest iżda ttestja xi ħaġa oħra. Żommu fil-kuntest tiegħu u nofs il-konfużjoni tisparixxi.
Ma hemm ebda mekkaniżmu universali x’nħabbru. Hemm tliet esperimenti b’sustanzi li jimblukkaw, dożi u kejl differenti. Aqra l-kundizzjonijiet l-ewwel. Il-konklużjonijiet jiġu wara.
Xi tfisser mogħdija alternattiva hawn
L-elettroni jidħlu fil-katina mill-Kumpless I (minn NADH) jew mill-Kumpless II (mis-suċċinat), jgħaddu mill-Kumpless III lejn iċ-ċitokromu c, imbagħad mill-Kumpless IV lejn l-ossiġnu. Il-gradjent li jinbena tul din il-mogħdija huwa dak li ċ-ċellola tuża biex tagħmel ATP.
L-affermazzjoni li teżisti mogħdija alternattiva tgħid li l-blu tal-metilen jiġbor l-elettroni qabel punt imblukkat u jwassalhom warajh. Iż-żebgħa ossidata tieħu l-elettroni minn NADH jew minn komponenti bikrin tal-katina, u ssir lewkoblu tal-metilen, u l-forma ridotta tgħaddihom liċ-ċitokromu c jew lura fil-katina. Jekk it-trasferiment iseħħ wara l-punt imblukkat, ir-respirazzjoni u l-potenzjal tal-membrana jirkupraw parzjalment. Jekk iseħħ fil-punt imblukkat jew qablu, xejn ma jirkupra.
Dettall wieħed tal-Kumpless III jiddetermina ħafna minn din it-tilwima. Il-kumpless iħaddem ċiklu Q b’żewġ siti għall-inibituri. L-antimiċina tintrabat mas-sit Qi. Il-mixotijażol jintrabat mas-sit Qo. Studju li juża wieħed biss minnhom ikun ittestja biss nofs il-kumpless.
L-ewwel studju: ebda mogħdija alternattiva fil-mitokondriji tal-moħħ tal-ġrieden
Gureev u l-kollegi użaw mitokondriji tal-kortiċi minn ġrieden C57BL/6, iżolati bid-diġitonina, u ttestjati f’0.1 mg protein per ml. Is-substrati koprew tliet kundizzjonijiet: piruvat flimkien ma’ malat f’5 mM kull wieħed, suċċinat f’10 mM ma’ glutamat f’2 mM, u L-prolina f’10 mM. Is-sustanzi li jimblukkaw kienu rotenone f’1 micromolar (Kumpless I) u antimiċina f’1 microgram per ml (Kumpless III). Id-dożi taż-żebgħa kienu 0.5, 1, u 2 micromolar, b’1 micromolar bħala l-konċentrazzjoni prinċipali. Il-metodi u t-traċċi tal-kejl jinsabu fil-komunikazzjoni ta’ FEBS Letters.
Il-mogħdija li tevita l-Kumpless I ħadmet. Ir-rotenone naqqas ir-respirazzjoni stimulata minn ADP minn madwar 121 għal madwar 2 nmol per minute per mg, u ż-żebgħa f’1 micromolar reġgħet żieditha għal madwar 21. Il-potenzjal tal-membrana rkupra bil-piruvat flimkien mal-malat u bl-L-prolina.
Il-mogħdija li tevita l-Kumpless III ma ħadmitx. L-antimiċina naqqset ir-respirazzjoni għal madwar 16, u ż-żebgħa żieditha biss għal madwar 20. Il-potenzjal tal-membrana ma rkupra bl-ebda substrat, b’dożi taż-żebgħa sa 5 micromolar. Id-data dwar il-perossidu indikat l-istess ħaġa: iż-żebgħa waħedha żiedet l-emissjoni tal-perossidu minn rata bażali qrib 76 pmol per minute per mg għal madwar 1170, 1460, u 1945 fit-tliet dożi, iżda l-antimiċina naqqset dak is-sinjal ikkawżat miż-żebgħa b’madwar 25, 88, u 96 fil-mija rispettivament. Kieku ż-żebgħa ridotta kienet tirreaġixxi direttament mal-ossiġnu, l-imblukkar tal-Kumpless III ma kellux irażżan is-sinjal. L-awturi ddeduċew li ż-żebgħa ridotta tiġi ossidata fis-sit Qo tal-Kumpless III, qabel il-punt imblukkat mill-antimiċina. Ċirkwit qasir, fi kliem: mid-donaturi għaż-żebgħa, miż-żebgħa lejn Qo, imbagħad ’il quddiem bil-mogħdija normali. Ir-rotenone jiġi evitat. L-antimiċina le.
It-tieni studju: mogħdija alternattiva parzjali fi tliet speċijiet, fiż-żewġ siti tal-inibituri
Svab u l-kollegi wessgħu d-disinn. Mitokondriji tal-moħħ minn ġrieden, firien, u fniek tal-Indi, iżolati b’Percoll, ġew ittestjati fl-istess konċentrazzjoni ta’ 0.1 mg per ml, bil-piruvat flimkien mal-malat jew bil-glutamat flimkien mal-malat f’5 mM kull wieħed. Użaw żewġ sustanzi li jimblukkaw il-Kumpless III: antimiċina A f’0.3 micromolar u mixotijażol f’1 micromolar. Iż-żebgħa kienet f’2 micromolar fil-biċċa l-kbira tat-testijiet, u f’0.5 fix-xogħol fuq iċ-ċitokromu c. It-tliet speċijiet kollha, bi protokolli mqabbla, jinsabu fl-artiklu b’aċċess miftuħ.
Iż-żewġ imblokki ġew evitati parzjalment, fit-tliet speċijiet kollha. Fil-mitokondriji tal-ġrieden, l-antimiċina rażżnet ir-respirazzjoni u ż-żebgħa żiditha b’madwar 60 fil-mija, minn bejn wieħed u ieħor 37 għal 59 nmol per minute per mg. Il-mixotijażol rażżanha bi 88 fil-mija, għal madwar 4.5, u ż-żebgħa żiditha ħames darbiet għal madwar 23. Il-potenzjal tal-membrana ġie ripolarizzat parzjalment fil-preżenza ta’ kwalunkwe wieħed miż-żewġ inibituri, u tkejjel b’żewġ żebgħat (safranin O u TMRM razjometriku) biex jiġu esklużi artefatti ottiċi.
Dan l-artiklu ttestja wkoll it-trasferiment direttament, xi ħaġa li l-ewwel studju qatt ma għamel. Iċ-ċitokromu c aċetilat eżoġenu f’25 micromolar ma ġiex ridott minn mitokondriji enerġizzati, bl-inibituri jew mingħajrhom, iżda ż-żieda taż-żebgħa wasslet għar-riduzzjoni fiż-żewġ każijiet. F’soluzzjoni tampun mingħajr ċelloli, NADH flimkien maż-żebgħa rreduċew iċ-ċitokromu c b’rata proporzjonali għal NADH. Qabża itwal, fi kliem: ekwivalenti riduċenti lejn iż-żebgħa, iż-żebgħa direttament lejn iċ-ċitokromu c, il-Kumpless IV lejn l-ossiġnu. Dik il-mogħdija taqbeż il-Kumpless III kompletament, u għalhekk iż-żewġ sustanzi li jimblukkaw jistgħu jiġu evitati.
Żewġ kejlijiet oħra jsostnu dik l-interpretazzjoni. Il-fluworexxenza ta’ NAD(P)H naqset meta ż-żebgħa żdiedet ma’ mitokondriji ttrattati bil-mixotijażol, jiġifieri l-ekwivalenti riduċenti bdew jgħaddu mill-mogħdija l-ġdida. U l-assorbanza taż-żebgħa f’660 nm segwiet kull żieda wara l-oħra, filwaqt li s-supernatanti miksuba biċ-ċentrifugazzjoni wrew li ż-żebgħa ossidata kienet tiġi kkonċentrata ġewwa mitokondriji enerġizzati aktar minn mitt darba, imbagħad kienet toħroġ meta l-potenzjal ikkollassa. Il-bilanċ tal-protoni jaqbel ukoll: meta jinqabżu l-passi tal-ippumpjar, jibqgħu madwar 2 protoni għal kull par ta’ elettroni minflok 10, għalhekk użu aktar mgħaġġel tal-ossiġnu b’ripolarizzazzjoni parzjali biss huwa dak li wieħed jistenna minn mogħdija alternattiva reali, mhux evidenza kontriha.
L-istess preparazzjoni pproduċiet risponsi li jistgħu jqarrqu b’min jaqra bla attenzjoni. Bl-inibitur flimkien maż-żebgħa, ADP naqqas ir-respirazzjoni minflok żiedha, u l-imblukkar tat-trasport stimulaha minflok naqqasha, filwaqt li l-potenzjal tal-membrana xorta mexa fid-direzzjonijiet normali. Il-konsum tal-ossiġnu waħdu jqarraq f’din is-sistema.
It-tielet studju: l-istudju tal-fwied li ttestja l-Kumplessi I u II, mhux III
Lee u Boelsterli użaw mitokondriji tal-fwied tal-ġrieden u epatoċiti kkultivati li ġarrbu ħsara minn efavirenz (Kumpless I, IC50 qrib 30 micromolar) u hydrazine, il-metabolit ta’ isoniazid (Kumpless II, IC50 qrib 30 micromolar). Iż-żebgħa f’madwar 30 micromolar irrestawrat l-ossidazzjoni ta’ NADH, il-potenzjal tal-membrana, u ATP filwaqt li naqqset l-ossidanti u l-mewt nekrotika. L-artiklu f’Redox Biology jimmudella dan bħala żebgħa li ġġorr l-elettroni minn mogħdija li tevita l-Kumplessi I u II bil-ħsara.
Dak ir-riżultat huwa kuntest stabbilit għall-parti preċedenti tal-katina, u ma jgħid xejn dwar il-Kumpless III għax fl-istudju ma ġie mblukkat xejn hemmhekk. Ma jistax jikkonferma jew jiċħad l-ebda wieħed miż-żewġ studji tal-moħħ.
Il-matriċi tal-kundizzjonijiet
| Kundizzjoni | Gureev 2019 | Svab 2021 | Lee 2014 |
|---|---|---|---|
| Speċi u tessut | Kortiċi tal-moħħ tal-ġrieden | Moħħ ta’ ġrieden, firien, fniek tal-Indi | Fwied tal-ġrieden, mitokondriji u ċelloli |
| Doża taż-żebgħa | 0.5 sa 2 micromolar, prinċipali 1 | 2 micromolar, 0.5 fit-testijiet ta’ cyt c | Madwar 30 micromolar |
| Sustanza li timblokka l-Kumpless III | Antimiċina 1 ug per ml, Qi biss | Antimiċina 0.3 uM flimkien ma’ mixotijażol 1 uM, Qi u Qo | Ebda waħda |
| Substrati | PM, suċċinat glutamat, prolina | PM jew GM | Marbuta ma’ NADH, ħsara f’I u II |
| Parametri ewlenin imkejla | Respirazzjoni, potenzjal, perossidu | Respirazzjoni, potenzjal b’żewġ żebgħat, NAD(P)H, stat redox taż-żebgħa, riduzzjoni ta’ cyt c | Enerġetika, potenzjal, ATP, ossidanti, mewt |
| Riżultat | Mogħdija li tevita l-Kumpless I iva, III le | Mogħdija alternattiva parzjali bi kwalunkwe wieħed miż-żewġ imblukkaturi ta’ III | Mogħdija li tevita l-ħsara f’I u II |
Erba’ raġunijiet għaliex iż-żewġ studji tal-Kumpless III jistgħu jkunu korretti dwar il-kundizzjonijiet tagħhom stess
1. Is-sustanza li timblokka ma kinitx l-istess intervent. Antimiċina waħedha f’1 microgram per ml kontra antimiċina f’0.3 micromolar flimkien ma’ sustanza separata li timblokka s-sit Qo. Mogħdija taż-żebgħa li twassal l-elettroni fis-sit Qo tfalli eżatt fejn tirnexxi mogħdija diretta lejn iċ-ċitokromu c. Sit wieħed ma jistax jirrappreżenta lit-tnejn.
2. Id-doża taż-żebgħa u ż-żmien kienu differenti. Konċentrazzjonijiet prinċipali ta’ 1 kontra 2 micromolar, f’sustanza li tiċċikla bejn stati redox u li l-assorbiment tagħha u r-riduzzjoni diretta taċ-ċitokromu c minnha jiddependu fuq il-konċentrazzjoni u ż-żmien. Differenzi żgħar fid-doża flimkien ma’ żminijiet differenti tal-kejl jistgħu jikxfu mogħdijiet differenti tal-istess netwerk.
3. Il-preparazzjonijiet kienu differenti. L-iżolament bid-diġitonina kontra l-iżolament bi gradjent ta’ Percoll jagħżel popolazzjonijiet mitokondrijali li jikkoinċidu iżda mhumiex identiċi. Il-konċentrazzjoni tal-proteina kienet l-istess, f’0.1 mg per ml, għalhekk dik il-varjabbli tiġi eskluża, iżda s-sottopopolazzjoni u l-integrità le. U l-ispeċi ġiet eskluża bħala kawża possibbli: it-tieni grupp irriproduċa l-fenotip tiegħu fil-ġrieden ukoll.
4. Il-kundizzjoni tas-substrat tiddetermina x’tista’ tagħmel iż-żebgħa. Tliet kundizzjonijiet ta’ substrati kontra pari marbuta ma’ NADH. Il-provvista ta’ NADH u l-potenzjal tal-membrana flimkien jiddeterminaw kemm titnaqqas malajr iż-żebgħa u fejn titqassam, u mogħdija li teħtieġ żebgħa ridotta ħdejn ċitokromu c ossidat tiddependi fuq dik l-għażla.
Kif taqra l-affermazzjoni li jmiss dwar mogħdija alternattiva
Staqsi liema kumpless ġie mblukkat, b’liema inibitur, f’liema sit u b’liema doża. Staqsi x’kienet il-konċentrazzjoni taż-żebgħa u meta ttieħed il-kejl. Staqsi dwar it-tessut, l-ispeċi, l-iżolament, il-konċentrazzjoni tal-proteina, u s-substrat. U staqsi jekk il-potenzjal, ir-respirazzjoni, l-istat redox, u test dirett tat-trasferiment jaqblux, għax il-konsum tal-ossiġnu waħdu indika direzzjoni żbaljata aktar minn darba hawn.
Is-sommarju ristrett jibqa’ validu. Hemm qbil dwar il-mogħdija taż-żebgħa li tevita l-Kumpless I. Fil-każ tal-Kumpless III, il-mitokondriji tal-ġrieden b’antimiċina f’1 microgram per ml u żebgħa f’1 micromolar ma juru ebda mogħdija alternattiva funzjonali, filwaqt li tliet speċijiet b’antimiċina f’0.3 micromolar jew mixotijażol f’1 micromolar u żebgħa f’2 micromolar juru mogħdija alternattiva parzjali bi trasferiment dirett miż-żebgħa lejn iċ-ċitokromu c. Dawk is-sentenzi jistgħu jeżistu flimkien. Kwalunkwe konklużjoni usa’ hija estrapolazzjoni.
Qari relatat iżomm l-affermazzjoni kkontestata fil-kuntest tal-kimika li dwarha hemm qbil: kif il-blu tal-metilen iċaqlaq l-elettroni għat-trasferiment f’katina, l-esperimenti dwar il-mogħdija li tevita l-Kumpless I għall-każ stabbilit fil-parti preċedenti tal-katina, il-kejl tal-potenzjal tal-membrana u l-artefatti tiegħu biex tifhem għaliex kienu meħtieġa żewġ żebgħat, u l-immaniġġjar fil-laboratorju ta’ sustanzi li jiċċiklaw bejn stati redox għan-nases tad-doża u taż-żmien.