L-Artikolu
Il-blu tal-metilen bħala antiossidant u proossidant: x’jibdel ir-riżultat?
Immaġina li żewġ laboratorji jittestjaw l-istess żebgħa blu u jirrapportaw riżultati opposti. Fl-ewwel wieħed, mitokondriji iżolati tal-moħħ jieħdu n-nifs aħjar u jipproduċu aktar ATP. Fit-tieni, l-istess preparazzjoni tirrilaxxa ħafna aktar perossidu tal-idroġenu. Iż-żewġ rapporti huma korretti. Jiddeskrivu l-istess ċiklu meqjus minn żewġ naħat, u l-konfużjoni tibda meta l-qarrejja jqisu naħa waħda bħala l-istorja kollha.
L-iżball hu li tistaqsi liema tikketta taqbel mal-molekula. Il-blu tal-metilen jittrasferixxi l-elettroni minn post għal ieħor, kif turi l-mappa tal-miri tiegħu fil-bijoloġija taċ-ċelloli f’kuntest usa’. Iż-żebgħa ossidata taċċetta l-elettroni u ssir leucoMB bla kulur. Il-leucoMB tgħaddi dawk l-elettroni lil hinn u terġa’ ssir blu. Dak li tosserva jiddependi minn min jagħti l-elettroni, min jirċevihom, u jekk is-sistema tistax telimina l-perossidu tal-idroġenu li jinħoloq matul il-proċess. Il-mistoqsija li għandha ssir qatt ma hi jekk iż-żebgħa hijiex antiossidant. Hi x’jippermettu l-kundizzjonijiet li jagħmel dan it-trasferiment.
Iċ-ċiklu li jipproduċi ż-żewġ naħat
Fid-dlam, iċ-ċiklu ewlieni hu qasir. NADH, NADPH, jew trasportaturi fil-katina respiratorja jirriduċu ż-żebgħa. Iż-żebgħa ridotta mbagħad għandha mogħdijiet alternattivi li jikkompetu bejniethom. Tista’ tgħaddi l-elettroni liċ-ċitokromu c u ssostni l-fluss madwar kumpless bil-ħsara, u għalhekk ir-respirazzjoni u l-potenzjal tal-membrana jirkupraw parzjalment meta l-kumpless I jew III jiġi mblukkat. Jew tista’ tgħaddi l-elettroni direttament lill-ossiġenu, u dan jirriġenera l-forma blu u jipproduċi perossidu tal-idroġenu. Billi ż-żebgħa tiġi rriġenerata, ammont żgħir jista’ jirrepeti dan iċ-ċiklu ħafna drabi, filwaqt li jikkonsma kontinwament ekwivalenti riduċenti u jipproduċi kontinwament il-perossidu.
Żewġ fergħat oħra jbiddlu l-kimika kompletament. Ram jew ħadid ħieles jikkonverti dak il-perossidu li jista’ jinxtered f’ossidanti lokali ħafna aktar distruttivi permezz ta’ reazzjonijiet tat-tip Fenton. Id-dawl aħmar jiftaħ fergħa fotokimika separata li fiha ż-żebgħa eċċitata tittrasferixxi l-enerġija lill-ossiġenu u tipproduċi ossiġenu singlet, speċi spjegata fid-dettall fl-ispjegazzjoni tal-fotokimika tat-tip I u tat-tip II. Iċ-ċikli redox fid-dlam, il-ħsara amplifikata mill-metalli, u l-ħsara fotodinamika huma tliet mekkaniżmi differenti li sempliċement għandhom l-istess molekula inizjali.
Matriċi tal-kundizzjonijiet u r-riżultati
It-tabella hawn taħt hi r-riżorsa li għandek iżżomm. Kull ringiela turi varjabbli waħda, id-direzzjoni li timbotta lejha, u l-esperiment li jsostniha. Pożittiv ifisser kejl protettiv jew imtejjeb. Negattiv ifisser aktar ossidanti, aktar tnaqqis fir-riżervi, jew aktar ħsara.
| Kundizzjoni | Direzzjoni tar-riżultat | X’wera l-esperiment |
|---|---|---|
| Konċentrazzjoni baxxa, 0.1 sa 1 uM, mitokondriji iżolati | Bijoenerġetika pożittiva flimkien ma’ aktar perossidu | 0.1 uM tejjeb il-konsum tal-ossiġenu fil-mitokondriji tal-qalb ta’ firien b’saħħithom u dijabetiċi; 100 nM sa 1 uM irrestawra parzjalment l-ATP, il-potenzjal tal-membrana, u l-assorbiment tal-kalċju f’mitokondriji tal-moħħ imblukkati, filwaqt li r-rilaxx tal-perossidu żdied f’kull kundizzjoni |
| Konċentrazzjoni ogħla, aktar minn 5 uM, ċelloli mċaħħda mill-glukożju | Sinjal negattiv ta’ ossidanti | Iċ-ċelloli endoteljali ossidaw sonda ġenerali għal ROS u tilfu l-glutathione ridott f’konċentrazzjonijiet ogħla minn 5 uM meta l-glukożju kien assenti; iż-żieda tal-glukożju ppreveniet it-tnejn |
| Substrati tal-kumpless I (glutamat flimkien ma’ malat) | Aktar perossidu | Kemm ix-xogħol fuq il-mitokondriji tal-moħħ kif ukoll dak fuq tal-qalb sab żieda fir-rilaxx tal-perossidu b’substrati marbuta ma’ NADH |
| Suċċinat flimkien ma’ rotenone, mitokondriji tal-qalb, 0.1 uM | Inqas perossidu f’dak il-protokoll | L-uniku kejl tal-perossidu fis-sett li wera effett ċar antiossidanti; innota li l-protokoll kien jinkludi rotenone u tessut differenti, għalhekk is-substrat waħdu ma jispjegahx |
| Dawl aħmar, 20 uM flimkien ma’ 630 nm | Ħsara negattiva fid-DNA | Ebda leżjoni sinifikanti fid-DNA mitokondrijali fid-dlam f’20 uM; l-istess konċentrazzjoni bid-dawl aħmar għamlet ħsara lil kull framment ittestjat |
| Konċentrazzjoni għolja ħafna fid-dlam, 100 uM | Ħsara selettiva negattiva fid-DNA | Leżjonijiet selettivi fid-DNA mitokondrijali f’sekwenzi sinjuri fil-purini, bidla sostanzjali mis-sinjal tal-perossidu f’konċentrazzjonijiet nanomolari |
| Ram jew ħadid flimkien ma’ NADH, DNA f’sistema mingħajr ċelloli | Leżjonijiet ossidattivi negattivi | Ir-ram idderieġa l-ħsara lejn sekwenza ta’ p53 suxxettibbli ħafna għall-ħsara; il-ħadid EDTA kkawża ħsara mifruxa; il-katalażi u l-kelaturi tal-metalli mblukkaw il-mogħdijiet rispettivi; żdiedet il-gwanina ossidata |
| Glukożju preżenti, ċelloli intatti | Attenwazzjoni protettiva minkejja ċikli aktar mgħaġġla | Il-glukożju żied ir-riduzzjoni taż-żebgħa iżda naqqas l-istress nett, konsistenti mal-provvista ta’ NADPH mill-mogħdija tal-pentożju fosfat għar-riċiklaġġ tal-antiossidanti |
| Ċelloli mgħobbija bl-askorbat | Imħallat: l-askorbat ikkunsmat, is-sinjal tas-sonda attenwat | Iż-żebgħa ossidat progressivament l-askorbat intraċellulari anke bil-glukożju preżenti, filwaqt li trażżnet parzjalment l-ossidazzjoni tas-sonda; ir-riżerva tad-difiżi ħallset il-prezz |
| Annimali ttrattati minn qabel b’rotenone, biż-żebgħa mogħtija l-ewwel | Riżultat pożittiv fit-tessut | Trattament minn qabel biż-żebgħa naqqas il-leżjonijiet fid-DNA mitokondrijali kkawżati minn rotenone fil-moħħ tan-nofs tal-ġrieden minkejja li żied il-perossidu f’mitokondriji iżolati |
Il-mudell li jidher fir-ringieli hu l-punt ewlieni. Il-produzzjoni tal-perossidu u l-protezzjoni bijoloġika huma żewġ assi separati. Trattament jista’ jagħti riżultat negattiv fuq l-ewwel wieħed u pożittiv fuq it-tieni fl-istess ħin.
Għaliex l-istess doża tagħti tweġibiet differenti
Il-konċentrazzjoni tiddetermina l-kapaċità tat-trasport, mhux id-destin. Ir-rilaxx tal-perossidu mill-mitokondriji tal-moħħ żdied b’mod li seta’ jitkejjel minn 50 nM ’il fuq f’xogħol fuq mitokondriji intatti tal-moħħ, filwaqt li ħsara ċara fid-DNA mitokondrijali kienet teħtieġ 100 uM fid-dlam. Din hi differenza ta’ madwar elfejn darba bejn l-ewwel sinjal u l-ġenotossiċità, iżda mhix marġni ta’ sikurezza. Il-punti finali tal-kejl, il-kompartimenti, u l-ħinijiet ta’ espożizzjoni huma differenti, għalhekk in-numri jindikaw fenomeni distinti aktar milli punti fuq kurva waħda. Id-diskussjoni dwar ir-rispons għad-doża tqiegħed dan it-tip ta’ differenza bejn sinjal baxx u ħsara għolja fil-kuntest usa’ tal-ormesi.
Is-substrat jiddetermina minn fejn jidħlu l-elettroni. Is-sorsi tal-enerġija marbuta ma’ NADH jipprovdu liż-żebgħa ħafna ekwivalenti riduċenti kemm għall-mogħdija alternattiva utli kif ukoll għar-reazzjoni mal-ossiġenu li taħlihom. Is-sommarju li spiss jiġi kkwotat, li s-suċċinat jagħmel iż-żebgħa antiossidant filwaqt li l-glutamat jagħmilha proossidant, jislet aktar mid-data milli din turi. Dan għaliex il-kundizzjoni tal-perossidu bis-suċċinat fl-istudju tal-qalb kienet tinkludi wkoll rotenone u kienet tuża tessut u doża differenti mix-xogħol fuq il-moħħ li sab żieda fil-perossidu b’kull substrat u f’kull stat ta’ respirazzjoni.
Id-dawl jaqleb il-mekkaniżmu, mhux biss il-kobor tal-effett. L-aktar kuntrast ċar fis-sett hu bejn 20 uM fid-dlam, li ma għamel xejn li seta’ jitkejjel fil-frammenti tad-DNA mitokondrijali, u 20 uM taħt dawl aħmar, li għamel ħsara lilhom kollha. Min iqabbel esperiment bid-dawl ma’ wieħed fid-dlam ikun qed iqabbel il-fotokimika maċ-ċikli redox.
Il-metalli jikkonvertu l-ossidant. Mingħajr metalli, iċ-ċiklu taż-żebgħa fid-dlam jipproduċi perossidu, molekula li tista’ tinfirex u li ċ-ċelloli jużaw ukoll bħala sinjal. Meta jkun hemm ram jew ħadid aċċessibbli, iż-żebgħa ridotta minn NADH issostni r-riduzzjoni tal-metall, u l-metall ridott jattiva l-perossidu biex jifforma speċi tat-tip idrossil jew tal-perossidu tar-ram ħdejn id-DNA. Hekk xogħol f’sistemi mingħajr ċelloli b’NADH u joni tal-metalli ipproduċa kemm ħsara selettiva f’siti suxxettibbli ħafna kif ukoll ħsara mifruxa fid-DNA mill-istess żebgħa inizjali. Il-mod kif il-kompartiment jimmaniġġja l-metalli, mhux iż-żebgħa waħedha, jiddetermina jekk din il-fergħa tkunx importanti.
L-istat tas-sorsi tal-enerġija jiddetermina jekk iċ-ċellola tistax tħallas il-prezz. F’ċelloli endoteljali esposti għal 2 sa 20 uM taż-żebgħa, it-tneħħija tal-glukożju kixfet il-kost ossidattiv filwaqt li l-provvista tal-glukożju eliminatu, minkejja li l-glukożju aċċellera wkoll ir-riduzzjoni taż-żebgħa. Ċikli aktar mgħaġġla b’difiżi sostnuti huma aħjar minn ċikli aktar bil-mod b’difiżi eżawriti. Qis kull stqarrija dwar ossidanti li tħalli barra l-istat tal-glukożju jew ta’ NADPH bħala inkompleta.
It-tessut jiddetermina l-apparat bijoloġiku disponibbli. Iċ-ċelloli endoteljali jirriġeneraw NADPH permezz tal-metaboliżmu tal-glukożju u għandhom riżervi ċitosoliċi ta’ antiossidanti. Il-mitokondriji iżolati ma għandhom xejn minn dan. Id-DNA ppurifikat lanqas għandu mekkaniżmi ta’ tiswija. Riżultat f’preparazzjoni waħda ftit ibassar dwar l-oħrajn, u għalhekk l-artiklu ppjanat dwar ir-risponsi speċifiċi għat-tessuti se jkollu jżomm dawn is-sistemi separati.
Il-kejl dirett mhuwiex id-difiża li sseħħ wara
Ħafna kitbiet jgħaqqdu żewġ livelli li l-esperimenti jżommu separati. Livell wieħed jistaqsi kemm deher ossidant. L-ieħor jistaqsi kif wieġbet iċ-ċellola.
It-testijiet tal-perossidu tat-tip Amplex huma l-eqreb tal-ewwel livell, u anke dawn jirrapportaw il-fluss nett, jiġifieri l-produzzjoni nieqes id-degradazzjoni nieqes l-esportazzjoni. L-istudju tal-mitokondriji tal-moħħ sab bidliet fiż-żewġ naħat: ġie ffurmat aktar perossidu u porzjon ta’ perossidu miżjud tneħħa aktar bil-mod. Aktar ’il quddiem fil-proċess hemm l-ossidazzjoni tal-glutathione, il-konsum tal-askorbat, il-gwanina ossidata, u l-leżjonijiet fid-DNA li jimblukkaw il-polimerażi. Kull pass iżid proċessi bijoloġiċi bejn l-ossidant u l-kejl.
L-enżimi antiossidanti mmexxija minn Nrf2 u l-bijoġenesi mitokondrijali jinsabu fit-tieni livell. Dawn huma programmi adattivi li polz ħafif ta’ perossidu jista’ jattiva, u l-awturi tal-istudju dwar il-protezzjoni tal-mitokondriji tal-moħħ jipproponu proprju dak l-istress ħafif bħala l-istimolu, filwaqt li jinnotaw li l-katina kawżali permezz ta’ Nrf2 tistrieħ fuq xogħol preċedenti aktar milli fuq dimostrazzjoni sħiħa tagħhom stess. Protezzjoni li tasal sigħat wara permezz ta’ proteini ġodda ma tfissirx li l-kimika inizjali kienet antiossidanti. Tfisser li avveniment żgħir proossidanti kiseb difiża akbar. Il-prinċipji ta’ kawtela biex taqra stqarrijiet bħal dawn, inklużi l-limiti tat-testijiet u d-differenzi bejn il-preparazzjonijiet, huma s-suġġett tal-gwida biex taqra r-riċerka dwar il-blu tal-metilen.
Għaliex it-testijiet ma jaqblux ma’ xulxin
Sonda ġenerali bħad-diidrofluworexxeina tirrapporta ossidazzjoni ġenerali tas-sonda, mhux konċentrazzjoni ta’ perossidu. Tiddependi mill-kimika tal-perossidażi u tal-eme u tista’ ma taqbadx żieda fil-perossidu li test Amplex ikkalibrat jaqbad. L-istudju tal-mitokondriji tal-moħħ sab żieda qawwija fil-perossidu mingħajr sinjal korrispondenti ta’ superossidu, u dan hu twissija kontra l-kwotazzjoni ta’ kwalunkwe stqarrija dwar effett antiossidanti bbażata fuq żebgħa waħda. Is-sovrapożizzjoni ottika hi kwistjoni leġittima għall-kontrolli sperimentali, billi ż-żebgħa tassorbi d-dawl viżibbli qrib il-meded komuni ta’ eċċitazzjoni u emissjoni. Iżda l-istudju bir-reqqa kkalibra kontra ammonti magħrufa ta’ perossidu, naqqas l-espożizzjoni għall-eċċitazzjoni bi ftit bidla fis-sinjal, u kkonferma t-tneħħija aktar bil-mod tal-perossidu b’elettrodu separat. L-interferenza hi xi ħaġa li trid tiġi ttestjata b’kontroll, mhux raġuni għal ċaħda awtomatika.
Ir-riżultat tal-kalċju juri l-istess ħtieġa ta’ preċiżjoni. L-espożizzjoni akuta għaż-żebgħa ma bidlitx l-ammont totali ta’ kalċju qabel it-tranżizzjoni tal-permeabbiltà fl-istudju tal-qalb, iżda tejbet ir-rata ta’ assorbiment tal-kalċju f’mitokondriji tal-moħħ imblukkati fl-istudju tal-mitokondriji tal-qalb iffukat fuq id-dijabete. Punti finali differenti, sistemi differenti, ebda kontradizzjoni.
Lista ta’ kontroll qabel tafda verdett
Qis kull verdett ta’ antiossidant jew proossidant bħala rapport dwar sistema, u staqsi ħames mistoqsijiet. F’liema konċentrazzjoni, u f’liema kompartiment. B’liema donatur tal-elettroni u liema aċċettatur li jikkompeti. Bid-dawl jew fid-dlam, u b’liema tul ta’ mewġa u doża. B’liema metalli disponibbli u b’liema riżervi ta’ enerġija u antiossidanti sostnuti. U b’liema test, li jkejjel il-fluss tal-ossidanti jew il-ħsara jew ir-rispons adattiv. Ibdel kwalunkwe tweġiba waħda u l-istess molekula tista’ tiċċaqlaq fil-matriċi minn protettiva għal ta’ ħsara mingħajr ebda paradoss.