Pewarnaan sel pipi dengan metilena biru: perkara yang perlu diperhatikan

Seorang pelajar meletakkan setitis suspensi sel pipi pada slaid, melihat melalui mikroskop dan hampir tidak nampak apa-apa. Beberapa bayang pucat melintasi medan yang terang. Dia melaraskan fokus, kemudian menambah pencahayaan, lalu menyimpulkan bahawa slaid itu kosong. Slaid itu tidak kosong. Sel-selnya ada. Sel-sel itu hampir lut sinar, dan sifat lut sinar itulah masalah utama yang cuba diatasi oleh pewarnaan ini.

Perbezaan antara jangkaan dengan imej itu wajar dijelaskan sebelum protokol bermula. Pelajar baharu menjangkakan mikroskop akan mendedahkan butiran seperti zum kamera yang memperlihatkan papan tanda di kejauhan. Mikroskop medan cerah mempunyai fungsi yang lebih khusus: ia menunjukkan perbezaan penyerapan cahaya. Sel pipi yang tidak diwarnakan menyerap hampir tiada cahaya, maka ia menghasilkan hampir tiada perbezaan. Metilena biru menambahkan perbezaan itu. Ia mengikat di dalam sel secara tidak sekata dan menukar struktur menjadi kontras. Setelah pelajar memahami konsep itu, setiap langkah seterusnya dapat difahami sebagai kesannya, bukan sekadar arahan yang perlu diikuti.

Pengetahuan asas tentang cara pewarnaan ringkas menambah kontras di makmal sekolah membantu di sini, dan ulang kaji tentang penyediaan mikroskop medan cerah sebelum pewarnaan dapat mengelakkan separuh daripada kegagalan penyediaan slaid. Kimia di sebalik warna itu dibincangkan dalam pengenalan kepada metilena biru dalam mikroskopi, yang menerangkan sebab pewarna khusus ini sering digunakan di meja makmal.

Protokol bilik darjah

Versi lekapan basah di bawah ialah pilihan asas yang lebih ringkas untuk kelas umum. Ia tidak memerlukan nyalaan api atau langkah penetapan. Varian calitan tetap yang digunakan dalam sesetengah manual kolej menambahkan pengeringan udara serta penetapan haba yang singkat, seperti dalam aktiviti calitan pipi North Central Texas College yang diterbitkan melalui Biology LibreTexts, tetapi penetapan haba ialah amalan mikrobiologi, bukan syarat untuk melihat sel epitelium.

Bahan dan peralatan yang diperlukan: slaid dan kaca penutup yang bersih, swab steril sekali guna (pilihan utama) atau pencungkil gigi rata yang baharu, botol penitis berisi larutan akueus metilena biru 0.5 hingga 1 peratus, air suling atau air ternyahion, kertas penyerap, sarung tangan dan mikroskop majmuk dengan pembesaran keseluruhan 100x dan 400x.

1. Berkumur dengan air biasa. Ini menyingkirkan zarah makanan yang kemudiannya menyerap pewarna dengan kuat dan mengganggu pemerhatian sel.
2. Setiap pelajar hanya mengambil sampel daripada pipinya sendiri. Gosok bahagian dalam pipi dengan lembut menggunakan swab steril yang baharu. Tekan, jangan kikis. Hentikan sebelum timbul sebarang rasa tidak selesa atau pendarahan.
3. Golekkan swab merentasi bahagian tengah slaid bersih untuk menghasilkan lapisan nipis. Lapisan nipis ialah faktor paling penting yang menentukan sama ada slaid dapat diperhatikan dengan jelas. Mendapan putih yang tebal akan diwarnakan menjadi jisim biru yang tidak dapat dibezakan strukturnya.
4. Tambahkan satu titis metilena biru pada calitan. Biarkan selama 1 hingga 3 minit. Satu minit sudah memadai dalam banyak protokol kolej; manual makmal sains Kelas IX NCERT menggunakan kira-kira 3 minit untuk lekapan sementara. Masa yang lebih lama bukan lebih baik, dan pewarnaan berlebihan ialah kesilapan masa yang paling lazim.
5. Bilas perlahan-lahan dengan air suling atau serap lebihan pewarna menggunakan kertas penyerap, mengikut protokol setempat. Latar belakang sepatutnya menjadi biru pucat, bukan biru tua pekat.
6. Turunkan kaca penutup secara menyerong supaya satu sisinya menyentuh dahulu, kemudian biarkan ia turun perlahan-lahan. Ini mengelakkan gelembung udara.
7. Mulakan dengan pembesaran rendah untuk mencari sel, pastikan fokus dan kedudukannya di tengah, kemudian beralih kepada 100x dan akhirnya 400x. Pada 400x, gunakan pelaras fokus halus sahaja.

Kepekatan pewarna perlu dijelaskan dengan tepat. Kebanyakan protokol sekolah menggunakan larutan akueus metilena biru sekitar 1 peratus. Larutan stok yang lebih pekat atau pendedahan yang lama menggelapkan latar belakang lebih cepat daripada nukleus, lalu membalikkan kontras yang menjadi asas latihan ini.

Mengendalikan bahan pipi dengan selamat

Sampel pipi mengandungi air liur dan mikroorganisma mulut yang normal, jadi anggap setiap calitan segar sebagai bahan yang berpotensi berjangkit walaupun penderma ialah rakan sekelas yang sihat. Garis panduan biokeselamatan American Society for Microbiology untuk makmal pengajaran menyatakan prinsip umum: nilai risiko sebelum sesi, pakai sarung tangan, lindungi mata jika percikan mungkin berlaku, basuh tangan selepas itu, nyahjangkit meja makmal dan buang bahan pakai buang yang tercemar melalui kaedah pelupusan sisa biologi yang diluluskan.

Empat peraturan bilik darjah menangani kebanyakan risiko. Satu penderma bagi setiap swab dan setiap slaid, jangan sekali-kali berkongsi. Ambil sampel sendiri sahaja, jangan sekali-kali mengambil sampel rakan di sebelah. Swab dan pencungkil gigi sekali guna mesti terus dimasukkan ke dalam bekas sisa yang ditetapkan, bukan diletakkan semula di atas meja makmal. Metilena biru sendiri meninggalkan kesan warna pada kulit dan pakaian serta merengsakan mata, jadi gunakan sarung tangan dan amalkan langkah kebersihan biasa semasa mengendalikan pewarna. Jangan lanjutkan latihan ini kepada pengkulturan apa-apa daripada calitan, dan jangan melakukan penetapan haba bahan manusia segar secara improvisasi di luar prosedur keselamatan sekolah.

Perkara yang perlu diperhatikan, dan sebab rupanya begitu

Pada 100x, cari sel yang lebar dan rata, berwarna biru pucat, dengan garis luar bujur atau poligon yang tidak sekata. Sel-sel itu terletak bersendirian atau dalam lapisan yang bertindih secara longgar. Setiap sel biasanya mempunyai satu bintik biru yang lebih gelap. Bintik itu ialah nukleus. Perhatikan susunannya juga: sel epitelium skuamus berbentuk kepingan nipis, bukan sfera, sebab itulah tepinya kelihatan seperti saduran retak dan bukannya belon bulat.

Pada 400x, tiga ciri dapat dibezakan dengan jelas. Sempadan sel kelihatan sebagai garis nipis yang lebih gelap mengelilingi sel. Sitoplasma memenuhi bahagian dalam dengan warna biru muda yang sekata. Nukleus kelihatan lebih gelap dan padat, sering berbentuk bujur, biasanya berhampiran tengah tetapi tidak semestinya. Minta pelajar merekodkan ketiga-tiganya bersama bentuk dan pembesaran, kerana itulah yang diminta dalam lembaran kerja.

Satu perkara berkaitan ketepatan penting di sini, dan banyak lembaran kerja tersilap mengenainya. Sempadan yang kelihatan sepadan dengan kawasan membran plasma, tetapi membran itu sendiri, iaitu dwilapisan lipid setebal kira-kira 7 hingga 10 nanometer, jauh di bawah had resolusi mikroskop sekolah. Yang dilihat oleh pelajar ialah pinggir optik sel serta pewarna yang terkumpul di situ. Peringatan yang sama terpakai kepada organel. Mitokondria, retikulum endoplasma, jasad Golgi dan ribosom tidak kelihatan dalam sediaan ini. Mikroskop cahaya konvensional dapat membezakan butiran sehingga kira-kira 0.2 mikrometer dalam keadaan yang baik, seperti yang diterangkan dalam maklumat asas biologi sel NCBI tentang alat mikroskopi, dan kebanyakan ultrastruktur berada di bawah atau berhampiran had itu. Pembesaran kosong yang lebih tinggi membesarkan imej tanpa menambahkan butiran.

Mengapakah nukleus diwarnakan paling gelap? Metilena biru ialah pewarna kationik, bercas positif dalam larutan, dan ia berinteraksi dengan bahan bercas negatif di dalam sel, terutamanya asid nukleik. Kromatin memusatkan DNA di dalam nukleus, maka nukleus mengumpulkan pewarna paling banyak. Sitoplasma mengandungi RNA dan molekul bercas lain, jadi ia turut diwarnakan, tetapi lebih tersebar dan lebih pucat. Penjelasan penting: metilena biru bukan pewarna khusus untuk DNA. Kajian tentang taburan metilena biru dalam pengimejan nukleus menerangkan bahawa kation itu berinteraksi dengan kawasan yang kaya dengan asid nukleik, dan kajian kuantitatif terdahulu tentang pengikatan metilena biru dalam sediaan sel mendapati kebanyakan pewarna yang terikat berkaitan dengan asid nukleik. Oleh itu, nukleus gelap bersama sitoplasma cerah ialah corak kontras, bukan ujian molekul.

Kesilapan yang mungkin dilakukan oleh pelajar, dan cara mentafsirkannya

Hampir setiap slaid yang gagal menunjukkan salah satu daripada lima corak. Ajar pelajar mengenal pasti masalah slaid dan bukannya mengulang penyediaannya tanpa memahami sebabnya.

Pewarnaan berlebihan menjadikan sel dan latar belakang sama-sama gelap sehingga nukleus tidak dapat dibezakan daripada medan pemerhatian. Atasinya dengan memendekkan masa pewarnaan atau membilas dengan lebih menyeluruh. Pewarnaan yang tidak mencukupi menghasilkan bayang pucat yang hilang apabila pencahayaan ditingkatkan; tambah masa dalam sela tiga puluh saat. Calitan tebal menghasilkan jisim padat yang bertindih sehingga tiada garis luar dapat dikenal pasti; pembetulannya ialah tindakan fizikal, iaitu menyebarkan calitan dengan lebih nipis pada percubaan seterusnya, kerana pembilasan tidak dapat menyelamatkan timbunan sel. Gelembung udara kelihatan seperti bulatan sempurna dengan pinggir gelap yang jelas dan mengelirukan pelajar baharu yang menyangkanya sebagai struktur; letakkan semula kaca penutup perlahan-lahan secara menyerong. Titik gelap kecil yang bertaburan pada atau di sekitar sel biasanya ialah bakteria mulut yang normal, seperti yang dinyatakan dalam protokol sekolah seperti prosedur sel pipi Ingrid Science. Titik-titik itu mengesahkan bahawa mulut didiami mikroorganisma, sesuatu yang mungkin mudah diingati oleh pelajar, tetapi spesiesnya tidak dapat dikenal pasti dalam latihan ini dan titik-titik itu tidak patut dilukis sebagai bahagian sel. Sisa makanan dan helaian mukus menyerap pewarna secara tidak sekata dan kuat; berkumur terlebih dahulu bertujuan mengurangkannya.

Perkara yang tidak dapat dilakukan oleh latihan ini

Ini ialah pemerhatian untuk tujuan pendidikan, bukan ujian diagnostik. Tiada aspek rupa sel dalam pewarnaan bilik darjah yang boleh mendiagnosis jangkitan, kanser atau sebarang penyakit, dan artikel ini tidak patut ditafsirkan sebagai mencadangkan sebaliknya. Sediaan ini menunjukkan bentuk, sempadan, sitoplasma dan nukleus pada dua pembesaran. Ia tidak menunjukkan ultrastruktur membran, butiran organel atau identiti molekul. Menyatakan batasan itu dengan jelas melindungi sains dan pelajar: hasil yang baik ialah lukisan berlabel yang betul dengan pembesaran dan pewarna yang direkodkan, bukan kesimpulan tentang kesihatan.

Lembaran kerja pelajar dan mikrograf berlabel

Dua bahan projek untuk halaman ini ialah mikrograf berlabel di atas dan lembaran kerja di bawah. Cetak satu lembaran kerja bagi setiap pelajar atau tayangkannya dan minta pelajar menyalin kotak-kotaknya ke dalam buku nota.

Cara menggunakannya dalam sesi 45 minit: sepuluh minit untuk taklimat keselamatan dan pengambilan sampel, sepuluh minit untuk pewarnaan dan pelekapan, lima belas minit untuk pemerhatian dan lakaran pada kedua-dua pembesaran, sepuluh minit untuk senarai semak dan perbandingan dengan mikrograf berlabel. Perkara dalam senarai semak sengaja ditumpukan pada pelaksanaan langkah. Calitan nipis, masa pewarnaan yang betul, nukleus lebih gelap daripada sitoplasma, pembesaran direkodkan. Pelajar yang dapat menandakan keempat-empatnya telah memahami konsep yang ingin diajarkan dalam pelajaran ini: mikroskop memaparkan perbezaan, dan pewarnaan menghasilkan perbezaan yang berbaloi untuk dipaparkan.