Pewarnaan ringkas biru metilena berbanding pewarnaan Gram: apa yang dapat dibuktikan oleh setiap kaedah

Seorang pelajar menyediakan sapuan daripada kultur berlabel E. coli, membanjirinya dengan biru metilena selama satu minit, membilasnya, lalu memeriksanya melalui kanta rendaman minyak. Sel berbentuk rod berwarna biru memenuhi medan pandangan. Laporan makmal menyatakan: "Rod Gram-negatif dikenal pasti sebagai E. coli." Pemerhatian itu betul. Namun, slaid itu tidak memberikan bukti yang mencukupi untuk kesimpulan tersebut.

Kesilapan itu berkaitan konsep, bukan teknik. Pelajar tersebut menganggap pewarnaan ringkas seolah-olah ia ujian pembezaan. Pewarnaan ringkas dan pewarnaan Gram menjawab soalan yang berbeza kerana kedua-duanya berasaskan konsep pewarnaan yang berlainan. Satu bertanya: apakah bentuk yang hadir. Yang satu lagi bertanya: bagaimanakah dinding sel bertindak balas apabila diuji. Jika kedua-duanya dikelirukan, slaid yang diwarnakan dengan betul boleh menghasilkan laporan yang tidak berasas.

Perbandingan ini membezakan kedua-dua kaedah, menunjukkan kesimpulan yang boleh dibuat daripada setiap hasil, dan menjawab dua soalan yang paling kerap ditanya oleh pelajar: bolehkah biru metilena digunakan dalam pewarnaan Gram, dan apakah yang sebenarnya ditunjukkan oleh pewarnaan biru metilena pada E. coli.

Jawapan ringkas

Pewarnaan ringkas biru metilena mewarnakan setiap sel yang boleh diwarnakan dengan warna biru yang sama. Oleh itu, ia memperlihatkan morfologi (rod, sfera, pilin) dan susunan (tunggal, berpasangan, berantai), tetapi tidak memberikan maklumat tentang kategori Gram. Pewarnaan Gram menambah iodin, langkah penyahwarnaan dan pewarna balas, lalu membezakan bakteria kepada Gram-positif (ungu) dan Gram-negatif (merah jambu atau merah) berdasarkan cara sampul selnya mengekalkan pewarna. Rod biru selepas pewarnaan biru metilena bermaksud "sel berbentuk rod hadir." Rod merah jambu selepas urutan Gram yang lengkap bermaksud "rod Gram-negatif hadir." Pernyataan kedua lebih kukuh kerana prosedur itu menjalankan ujian tambahan.

Untuk mengetahui kumpulan kaedah bakteria satu pewarna yang lebih luas yang merangkumi kaedah dalam artikel ini, lihat atlas pewarnaan mikroskopi.

Pewarnaan ringkas: satu pewarna, satu soalan

Biru metilena ialah pewarna bes (kationik). Ion berwarnanya membawa cas positif dan mengikat struktur bercas negatif dalam sel, termasuk asid nukleik dan kumpulan berasid pada permukaan, menyebabkan sel kelihatan biru pada latar belakang pucat. OpenStax menerangkan prinsip pewarnaan positif ini dalam bab pewarnaannya. Kation pewarna itu sendiri ialah ion fenotiazina kecil dan rata yang dihuraikan dalam rujukan kimia biru metilena; ion lawan klorida tidak menghasilkan warna tersebut.

Protokol pengajaran standard sengaja dibuat ringkas: sediakan sapuan nipis, keringkan di udara, lakukan fiksasi haba, banjiri dengan larutan akueus biru metilena sekitar 1% selama kira-kira satu minit, bilas perlahan-lahan dengan air, serap airnya hingga kering, dan periksa menggunakan rendaman minyak. Protokol pengajaran LibreTexts memberikan kaedah 1% selama satu minit ini secara tepat, sambil menyatakan bahawa sesetengah makmal memanjangkan tempohnya. Tiada mordan, tiada penyahwarna, tiada pewarna kedua. Ketiadaan bahan-bahan itulah perkara utamanya. Dengan hanya satu pewarna dan tanpa penyingkiran terpilih, setiap sel yang mengikat pewarna akhirnya mempunyai warna yang sama.

Bagi E. coli, medan pandangan yang dijangka ialah rod biru (basil), secara tunggal, berpasangan atau dalam kelompok kecil. Warna biru berasal daripada pewarna. Bentuk rod berasal daripada organisma. Namun, gabungan itu tidak mengenal pasti organisma tersebut, kerana banyak spesies berbentuk rod dan banyak rod menjadi biru dalam pewarnaan ringkas. ATCC menjelaskan batas yang hanya melibatkan morfologi ini dalam panduan kultur mikrobiologinya. Laporan yang betul menyatakan: "basil biru diperhatikan." Sebarang kesimpulan selain bentuk dan susunan memerlukan lebih banyak bukti.

Pewarnaan Gram: empat reagen, satu ujian tindak balas

Pewarnaan Gram ialah pewarnaan pembezaan. Semua sel menjalani urutan yang sama, dan pemerhatian dibuat untuk menentukan sel yang mengekalkan pewarna pertama dan sel yang kehilangannya. Protokol pewarnaan Gram American Society for Microbiology menetapkan urutan standard empat langkah: kristal violet (pewarna utama), iodin Gram (mordan), alkohol atau alkohol aseton (penyahwarna), kemudian safranin (pewarna balas).

Model pengajaran standard menerangkan perbezaan ini melalui struktur sampul sel. Sel Gram-positif mempunyai dinding peptidoglikan tebal yang mengalami dehidrasi dan mengekalkan kompleks kristal violet-iodin semasa bilasan alkohol. Sel Gram-negatif mempunyai lapisan peptidoglikan nipis serta membran luar yang kaya dengan lipid, yang diganggu oleh penyahwarna. Oleh itu, kompleks tersebut tersingkir semasa pembilasan dan sel kemudian menyerap safranin. Ulasan pewarnaan Gram di NCBI Bookshelf memberikan penjelasan tentang dinding sel ini. Pakar menambah bahawa keseluruhan proses fizikokimia lebih rumit daripada ketebalan dinding semata-mata, tetapi untuk tafsiran di meja makmal, aturan tindak balas ini tetap terpakai: ungu bermaksud pewarna dikekalkan, merah jambu bermaksud pewarna hilang lalu sel diwarnakan dengan pewarna balas.

Panel ilustrasi. Lukisan bergaya untuk perbandingan kaedah, bukan mikrograf kamera. Warna dipermudah untuk mengajar logiknya: satu warna dalam pewarnaan ringkas, dua warna selepas penyahwarnaan Gram.

Bolehkah biru metilena digunakan dalam pewarnaan Gram

Soalan ini mempunyai dua tafsiran, dan setiap satunya memerlukan jawapan yang berbeza.

Tafsiran pertama: bolehkah satu langkah membanjiri sapuan dengan biru metilena menggantikan seluruh urutan Gram. Tidak. Tanpa iodin, penyahwarna dan pewarna balas, tiada langkah pembezaan, maka tiada kategori Gram yang diuji. Medan biru selepas penggunaan biru metilena sahaja ialah hasil pewarnaan ringkas walaupun botolnya terletak di sebelah reagen Gram. Jangan rekodkannya sebagai hasil Gram.

Tafsiran kedua: bolehkah biru metilena menggantikan safranin sebagai pewarna balas pada langkah 4. Dari segi fungsi, ia boleh mewarnakan sel yang dinyahwarnakan, dan latihan dalam buku teks menjangkakan sel Gram-positif berwarna ungu serta sel Gram-negatif berwarna biru selepas penggantian tersebut. Logik ini munasabah kerana sel Gram-negatif yang dinyahwarnakan dengan betul hampir tidak berwarna dan akan menyerap pewarna kationik lain. Namun, ini bukan protokol standard. Protokol ASM menetapkan safranin, dengan alternatif yang diiktiraf seperti fuksin bes dalam sesetengah variasi, bukan biru metilena. Terdapat juga kelemahan praktikal: biru lebih sukar dibezakan daripada ungu berbanding merah jambu daripada ungu, terutamanya bagi pemula dan apabila lampu mikroskop sudah malap. Untuk kerja kursus dan sebarang hasil yang penting, gunakan pewarna balas yang dinyatakan dalam protokol anda, biasanya safranin, dan anggap pewarna balas biru metilena sebagai variasi demonstrasi, bukan kaedah standard yang setara.

Soalan berkaitan tentang perbandingan biru metilena dengan pilihan satu pewarna yang lain dibincangkan dalam perbandingan pewarnaan ringkas bakteria.

Apa yang dibuktikan oleh pewarnaan biru metilena pada E. coli, dan apa yang tidak dibuktikannya

E. coli ialah rod Gram-negatif, tetapi ayat itu menggabungkan fakta daripada beberapa kaedah: morfologi daripada mikroskopi, tindak balas Gram daripada pewarnaan Gram, dan identiti daripada kultur serta ujian biokimia atau molekul. Sapuan biru metilena hanya menyumbang bahagian pertama. Ia membuktikan bahawa sel berbentuk rod hadir dalam sampel yang diwarnakan dan menunjukkan susunannya. Ia tidak membuktikan tindak balas Gram, kerana tiada ujian penyahwarnaan dijalankan. Ia tidak mengenal pasti spesies, kerana rod daripada banyak spesies kelihatan serupa pada resolusi ini.

Di sinilah laporan sering tersilap dengan cara yang boleh dijangka. Penulis memasukkan pengetahuan latar ("kultur ini sepatutnya E. coli, dan E. coli ialah Gram-negatif") ke dalam pernyataan pemerhatian, menyebabkan slaid seolah-olah mengesahkan sesuatu yang sebenarnya hanya diandaikan. Laporan yang lebih jelas memisahkan maklumat tersebut: "Pewarnaan ringkas biru metilena: basil biru diperhatikan; morfologi sahaja, tiada kategori Gram diuji." Kemudian, jika pewarnaan Gram dijalankan dengan betul berserta kawalan: "Pewarnaan Gram: rod merah jambu, selaras dengan Gram-negatif." Identiti spesies ditentukan kemudian melalui aliran kerja pengenalpastian, bukan daripada warna sahaja.

Panduan tafsiran praktikal

Gunakan aturan keputusan ini di meja makmal. Jika semua sel mempunyai satu warna dan protokol menggunakan satu pewarna tanpa penyahwarna, anda telah menjalankan pewarnaan ringkas. Laporkan bentuk, anggaran saiz dan susunan. Berhenti setakat itu. Jika protokol menggunakan kristal violet, iodin, penyahwarna dan pewarna balas berserta kawalan positif dan negatif yang diketahui, anda telah menjalankan pewarnaan Gram. Laporkan warna serta morfologi: kokus ungu berantai, rod merah jambu, dan sebagainya.

Tiga kesilapan menjadi punca kebanyakan kekeliruan. Pertama, mentafsir rod biru secara berlebihan sebagai pengesahan E. coli. Kedua, merekodkan slaid biru metilena di bawah tajuk "pewarnaan Gram" dalam buku nota, yang akan disalahtafsir oleh pembaca kemudian. Ketiga, menukar pewarna balas sewenang-wenangnya lalu membandingkan warna antara makmal seolah-olah palet warnanya sama. Setiap kesilapan mempunyai penyelesaian yang sama: nyatakan nama kaedah yang benar-benar dijalankan, dan buat kesimpulan hanya tentang perkara yang diuji oleh kaedah tersebut.

Pewarnaan ringkas mempunyai peranannya justeru kerana kesimpulan yang boleh dibuat daripadanya terhad. Ia pantas, tidak terlalu sensitif terhadap sedikit variasi teknik, dan memadai apabila soalan berkaitan morfologi: adakah sesuatu hadir, dan apakah bentuknya. Apabila soalan berkaitan pengelasan, jalankan ujian pembezaan. Slaid biru menunjukkan rupa sel. Slaid ungu atau merah jambu menunjukkan tindak balas dinding selnya. Tiada satu pun slaid itu, secara bersendirian, dapat menentukan spesies.