Penjelasan pewarna biru metilena beralkali Loeffler dan polikrom

Tiga botol boleh diletakkan bersebelahan di meja pewarnaan, setiap satunya berlabel suatu varian biru metilena. Satu berlabel biru metilena akueus 1%. Satu berlabel biru metilena beralkali Loeffler. Satu lagi berlabel biru metilena polikrom. Pekerja yang sibuk mengambil mana-mana botol yang paling dekat. Sapuan kemudian terwarna terlalu pudar, atau terlalu sekata birunya, atau menunjukkan rona ungu yang tidak dijangka, lalu sampel dipersalahkan atas hasil tersebut.

Ini ialah masalah formulasi, bukan masalah sampel. Ketiga-tiga larutan mengandungi pewarna yang berkaitan, tetapi menggunakan konsep pewarnaan yang berbeza. Satu ialah pewarna kationik biasa pada pH hampir neutral. Satu lagi ialah pewarna yang sama, tetapi dipertingkat tindakannya dengan alkali. Yang ketiga bukan lagi pewarna tunggal, sebaliknya campuran yang sengaja dioksidakan. Jika tersalah pilih, prinsip pewarnaan berubah semasa anda menggunakannya.

Jawapan ringkas

Biru metilena akueus biasa ialah asas perbandingan: kira-kira 1% pewarna dalam air, iaitu pewarna kationik ringkas untuk morfologi bakteria dan mikroskopi umum. Biru metilena beralkali Loeffler menambahkan sedikit alkali cair yang disukat kepada larutan stok beralkohol yang dicairkan dalam air. Ini menaikkan pH dan menguatkan pengikatan pewarna kationik pada struktur bakteria yang berasid. Biru metilena polikrom ialah biru metilena yang sengaja dimatangkan melalui pengoksidaan dalam alkali. Oleh itu, botolnya mengandungi campuran homolog yang dinyahmetilkan (azure A, azure B, azure C), tionin dan ungu metilena bersama baki biru metilena, dan campuran itu mewarnakan struktur yang berbeza dengan rona yang berbeza.

Jika anda hanya mengingati satu ayat: pengalkalian mengubah keamatan pewarnaan, manakala pembentukan polikrom mengubah warna pewarnaan.

Biru metilena akueus biasa: titik rujukan

Formulasi paling ringkas ialah biru metilena yang dilarutkan dalam air, lazimnya pada 1% w/v, tanpa alkali dan tanpa pengoksidaan. Spesies berwarna itu ialah kation metiltioninium dengan ion lawan klorida, suatu pewarna fenotiazina kecil dan rata yang diterangkan dalam rekod biru metilena PubChem sebagai metiltioninium klorida. Sebagai kation, ia mengikat rangka fosfat asid nukleik dan kumpulan berasid pada dinding sel bakteria, lalu mewarnakan sel biru pada latar belakang cerah.

Kelebihannya ialah hasil yang boleh dijangka. Nukleus dan bakteria kelihatan biru. Kontrasnya sederhana. Organisma yang kelihatan samar mungkin terwarna dengan lemah, dan inilah batasan yang cuba diatasi oleh Loeffler. Untuk kelompok pewarna ringkas bakteria yang lebih luas, yang merangkumi larutan ini, lihat gambaran keseluruhan pewarnaan ringkas bakteria. Ketelitian dalam mengenal pasti identiti pewarna tetap penting: biru metil ialah molekul yang sama sekali berbeza, seperti yang dijelaskan dalam biru metil berbanding biru metilena. Oleh itu, carian katalog berdasarkan nama warna sahaja boleh memberikan kelas pewarna yang salah.

Biru metilena beralkali Loeffler: pewarna yang sama, tindakan lebih kuat

Resipi klasik Loeffler menggabungkan larutan stok biru metilena beralkohol dengan alkali cair dalam air. Versi buku teks menetapkan 0.3 g pewarna dalam 30 mL etanol 95% ditambah 100 mL kalium hidroksida akueus 0.01% (atau secara setara, 30 mL biru metilena beralkohol tepu, 100 mL air suling dan 1 mL KOH 1%), menghasilkan larutan kerja dengan kepekatan pewarna hampir 0.3% pada pH yang jelas beralkali. Versi komersial mengikuti prinsip yang sama, dan katalog pewarna mikrobiologi Thermo Fisher menyenaraikan biru metilena beralkali Loeffler bersama varian polikrom dan akueus sebagai item katalog berasingan dengan tujuan penggunaan yang berbeza.

Alkali ialah unsur utama yang menghasilkan kesan tersebut. Peningkatan pH menyahprotonkan kumpulan karboksil dan fosfat pada spesimen, lalu meningkatkan kepadatan tapak bercas negatif. Sementara itu, larutan stok etanol memastikan pewarna terlarut sepenuhnya supaya ia sampai ke tapak tersebut dalam bentuk monomer. Hasilnya ialah pewarnaan bakteria yang lebih cepat dan lebih pekat berbanding pewarna akueus neutral, dengan bakteria berbentuk rod dan kokus berwarna biru tua yang lazim dilihat dalam sapuan bakteriologi rutin. Masa pewarnaan biasanya satu hingga tiga minit, diikuti pembilasan dengan air.

Penggunaan klasiknya ialah Corynebacterium diphtheriae yang dibiakkan pada medium serum Loeffler: bakteria berbentuk rod langsing, sering berbentuk belantan, dengan granul metakromatik Babes-Ernst yang menyimpan polifosfat dan terwarna dengan kuat. Gandingan medium dan pewarna ini mempunyai sejarahnya sendiri; kedua-duanya dikaitkan dengan ahli bakteriologi yang sama, dan kontras granul memberikan manfaat diagnostik. Selain kerja berkaitan difteria, pewarna ini berfungsi sebagai pewarna bakteriologi umum untuk sapuan daripada kultur, untuk melihat morfologi Neisseria dalam sapuan klinikal, dan dalam keadaan yang tidak memerlukan pewarnaan Gram tetapi biru akueus biasa terlalu pudar. Ia ialah pewarna monokrom. Semua struktur berasid mengambil suatu rona biru. Apabila protokol memerlukan pembezaan warna, alkali sahaja tidak dapat menghasilkannya.

Satu perkara praktikal yang perlu diberi perhatian: larutan pewarna beralkali merosot dan membentuk mendakan semasa penyimpanan serta penyerapan karbon dioksida. Makmal sama ada menyediakan isipadu yang sederhana atau membeli larutan katalog dan mematuhi tempoh hayat simpannya, bukannya terus menggunakan botol lama yang kini meninggalkan mendapan pada setiap slaid.

Biru metilena polikrom: satu nama, beberapa pewarna

Biru metilena polikrom bermula dengan pewarna yang sama, tetapi melalui pengoksidaan terkawal dalam alkali, yang secara sejarah disebut pematangan atau pembentukan polikrom. Penuaan beralkali, pemanasan dengan karbonat, atau pengoksidaan menggunakan agen seperti dikromat menyingkirkan kumpulan metil daripada substituen dimetilamino secara berperingkat. Produknya ialah campuran: baki biru metilena bersama azure B (kehilangan satu metil), azure A dan azure C (penyahmetilan lanjut), tionin (dinyahmetilkan sepenuhnya), serta produk sampingan pengoksidaan daripada keluarga ungu metilena. Setiap komponen mempunyai rona dan afiniti tisu tersendiri, maka campuran itu menghasilkan pewarnaan metakromatik: nukleus, granul, musin dan rawan masing-masing mengambil tona yang berbeza daripada biru hingga merah-ungu.

Kimia ini sama dengan kimia di sebalik pewarna darah yang terkenal. Penyelidik awal mendapati bahawa biru metilena yang dialkalikan mewarnakan nukleus parasit malaria dengan rona ungu, tetapi larutan akueus matang mereka tidak stabil dan membentuk mendakan dalam beberapa hari. Ulasan tentang bagaimana pewarna darah ungu dicipta menelusuri cara Malachowski dan Romanowsky menggunakan kesan ini secara berasingan pada 1891, cara metanol diperkenalkan untuk menstabilkan mendakan pewarna dan memfiksasi sapuan tanpa haba, serta cara Giemsa kemudian mempiawaikan campuran berasaskan azure B yang disukat bersama eosin dengan penstabilan gliserol. Pewarna jenis Giemsa moden berasal secara langsung daripada biru metilena polikrom bersama eosin, iaitu gabungan yang menghasilkan kesan Romanowsky. Untuk butiran tentang gandingan eosin dan komponen azure B, lihat pewarna jenis Romanowsky dan interaksi azure B dengan eosin.

Oleh sebab ia suatu campuran, biru metilena polikrom secara semula jadi ialah formulasi yang paling kurang seragam antara ketiga-tiganya. Keseimbangan ronanya yang tepat bergantung pada kaedah dan tahap pengoksidaan. Sebab itulah pembekal histologi menjualnya sebagai produk tersendiri dengan ujian prestasinya sendiri, bukannya sebagai larutan Loeffler yang telah dituakan. Kegunaan lazim termasuk menampakkan granul sel mast, musin dan rawan secara metakromatik, memperlihatkan perincian sel plasma, serta menunjukkan Helicobacter pylori dalam keratan tisu melalui kaedah polikrom jenis Goodpasture. Ia pilihan yang tepat apabila tujuannya ialah pembezaan mengikut warna, dan pilihan yang salah apabila protokol menjangkakan siluet bakteria monokrom yang jelas.

Perbandingan formulasi dan tujuan

Gunakan jadual ini sebagai panduan membuat keputusan. Jika spesimen terwarna terlalu pudar, ubah konsep pH dan gunakan Loeffler. Jika semuanya terwarna tetapi tiada struktur yang dapat dibezakan, ubah konsep pewarna dan gunakan polikrom. Jika sapuan Loeffler menunjukkan granul dengan sangat jelas tetapi penyelia bertanya mengapa nukleus dan sitoplasma berwarna biru yang sama, jawapannya ialah tiada pewarna monokrom beralkali yang dapat memenuhi keperluan pembezaan itu. Keperluan tersebut memerlukan keluarga polikrom dan derivatif pewarna darahnya.

Mengelakkan kekeliruan lazim

Dua kesilapan menjadi punca kebanyakan kekeliruan. Yang pertama ialah menganggap Loeffler boleh saling menggantikan biru metilena biasa kerana kedua-duanya kelihatan biru di dalam botol. Kedua-duanya berbeza dari segi pH dan keamatan, dan menggantikan Loeffler yang ditetapkan dengan pewarna neutral menghilangkan kontras granul yang menjadi asas protokol tersebut. Yang kedua ialah menganggap mana-mana larutan biru beralkali yang lama atau yang tertua secara tidak sengaja sebagai polikrom. Penuaan tanpa kawalan menghasilkan campuran yang tidak diketahui pada kepekatan yang tidak diketahui, sedangkan larutan polikrom sebenar disediakan melalui kaedah pengoksidaan yang ditetapkan dan, dalam keluarga pewarna darah, digabungkan dengan eosin yang disukat. Sejarah memberikan pengajaran di sini: larutan akueus matang yang tidak stabil pada 1890-an digantikan dengan formulasi bermetanol yang distabilkan, tepat kerana campuran tanpa kawalan tidak dapat dihasilkan semula secara konsisten. Pengajaran ini wajar diingati sebelum mewarnakan slaid diagnostik menggunakan botol yang usianya tidak pasti.

Ketelitian terhadap nama melengkapkan langkah ini. Sahkan item katalog (akueus berbanding Loeffler berbanding polikrom), kandungan pewarna dan tujuan penggunaan pada label, bukannya membuat andaian berdasarkan warna. Ketiga-tiga formulasi berkongsi asal kromofor yang sama. Tujuannya tidak sama.