Penyelidikan antimikrob metilena biru: bakteria, kulat dan pengaktifan cahaya

Dua pembaca melihat frasa antimikrob metilena biru dan membayangkan perkara yang berbeza. Seorang membayangkan cecair biru yang meracuni mikrob apabila bersentuhan dengannya. Seorang lagi membayangkan prosedur yang menggunakan pewarna bersama cahaya merah untuk memusnahkannya. Kedua-dua gambaran itu ada benarnya. Namun, kedua-duanya tidak merangkumi konsep tersebut sepenuhnya, dan kekeliruan antara kedua-duanya menjadi punca kebanyakan dakwaan dalam talian tersasar.

Perbezaan itulah yang menjadi tumpuan ulasan ini. Metilena biru mempunyai ketoksikan sederhana dalam gelap pada kepekatan yang mencukupi. Dengan cahaya merah, ia menjadi pemeka cahaya: ia menyerap foton, mencapai keadaan triplet reaktif, dan mencetuskan tindak balas kimia oksidatif yang merosakkan banyak sasaran serentak. Proses yang diaktifkan cahaya itu mempunyai namanya sendiri, iaitu terapi fotodinamik antimikrob, serta syarat-syaratnya sendiri. Kepekatan semata-mata tidak menentukannya. Panjang gelombang, dos cahaya, inkubasi, oksigen dan organisma menentukan hasilnya.

Dua konsep pembunuhan mikrob

Pertimbangkan dahulu konsep dalam gelap. Metilena biru ialah pewarna fenotiazinium bercas positif. Ia berinteraksi dengan lapisan pembungkus mikrob, memasuki sel pada tahap yang berbeza-beza, dan terlibat dalam tindak balas redoks serta pengikatan. Tiada foton terlibat. Pembunuhan berlaku, tetapi hanya pada kepekatan yang berbeza-beza dengan ketara mengikut organisma, dan mekanismenya bukan melalui satu sasaran tunggal yang jelas.

Konsep fotodinamik menambahkan cahaya. Foton merah sekitar 630 hingga 680 nm bertindih dengan jalur penyerapan pewarna, dengan puncak monomer berhampiran 664 nm. Penyerapan mengalihkan pewarna ke keadaan singlet yang singkat, kemudian ke keadaan triplet yang lebih lama. Dari situ, dua kumpulan tindak balas berlaku. Dalam tindak balas kimia Jenis I, keadaan triplet memindahkan elektron kepada substrat dan memulakan laluan radikal yang merangkumi spesies superoksida dan hidroksil. Dalam tindak balas kimia Jenis II, ia memindahkan tenaga secara langsung kepada oksigen dalam keadaan asas dan menghasilkan oksigen singlet. Kedua-duanya boleh berlaku serentak, dan menganggap pewarna itu sebagai agen oksigen singlet semata-mata adalah terlalu ringkas. Satu ulasan hubungan struktur-aktiviti pemeka cahaya fenotiazinium menunjukkan perkara ini secara langsung: dalam kalangan pewarna berkaitan, fototoksisiti terhadap bakteria tidak bergantung pada hasil oksigen singlet semata-mata, kerana pengambilan, penempatan dan penurunan kepada bentuk leuko yang tidak aktif sama pentingnya dengan fotofizik. Fotokimia di sebalik aturan panjang gelombang diterangkan dalam ulasan pelengkap tentang pewarna bersama cahaya merah.

Oksigen singlet menjadi asas kepada satu sifat yang berguna. Ia bertindak balas dengan banyak biomolekul serentak, maka serangannya bersifat pelbagai faktor dan bukannya menyasarkan satu enzim atau protein pengikat sahaja. Satu huraian asas tentang kemoterapi antimikrob fotodinamik menjelaskan bahawa inilah sebab profil kerintangan konvensional kurang berpengaruh: protein pengikat penisilin tambahan atau topoisomerase yang bermutasi tidak menghalang ledakan oksigen reaktif. Logik itu terbukti dalam ujian terhadap Staphylococcus aureus yang rintang terhadap metisilin dan enterokokus yang rintang terhadap vankomisin, seperti yang ditunjukkan dalam matriks di bawah. Ini tidak bermakna kerintangan mustahil berlaku, cuma mekanismenya berbeza. Pam efluks dan pertahanan antioksidan masih boleh mengubah dos yang diperlukan, khususnya dalam kulat.

Matriks organisma dan model kajian

Jadual ini ialah kandungan utama artikel. Setiap nilai khusus kepada protokolnya: pewarna yang sama, tetapi dos cahaya atau inkubasi yang berbeza menghasilkan angka yang berbeza. Jangan anggap MBC, MLC dan MIC boleh digunakan saling ganti. MBC dan MLC di sini bermaksud tiada organisma yang terselamat dalam subkultur, manakala MIC bermaksud perencatan pertumbuhan. Keadaan cahaya disertakan bagi setiap entri.

Tiga corak jelas kelihatan. Pertama, stafilokokus Gram positif mati pada kepekatan mikromolar yang rendah, manakala bakteria berbentuk rod Gram negatif memerlukan kira-kira seratus kali lebih banyak pewarna dalam gelap, kerana membran luar bakteria Gram negatif mengehadkan kemasukan. Cahaya merapatkan jurang itu tetapi tidak menghapuskannya. Kedua, tindakan antikulat metilena biru memang wujud tetapi bergantung pada keadaan: pembunuhan antikulat metilena biru terhadap Candida meningkat dengan ketara apabila dos cahaya meningkat, dan satu perubahan fenotip seperti pengekspresian pam efluks yang berlebihan boleh menghapuskan kesan pembunuhan 5 log pada dos yang sama. Ketiga, biofilem matang berkelakuan berbeza daripada suspensi, dan baris biofilem oral perlu dilihat dalam konteks ini.

Bakteria: apabila cahaya paling membantu, dan apabila ia tidak membantu

Stafilokokus ialah contoh yang peka. Malah, nilai dalam jadual ulasan bagi MRSA epidemik berada pada atau di bawah nilai pembanding vankomisin apabila cahaya digunakan, dan derivatif dimetilasi memberikan hasil yang lebih baik lagi kerana metilasi meningkatkan lipofilisiti dan hasil oksigen singlet sambil menghalang penurunan kepada bentuk leuko. Perincian kimia itu penting: ia menunjukkan bahawa pembunuhan terhasil daripada gabungan penghantaran dan fotofizik, bukan fotofizik semata-mata.

Organisma Gram negatif menggambarkan aspek penghantaran. Pseudomonas memerlukan 500 uM dalam gelap dan 25 uM dengan cahaya, iaitu peningkatan dua puluh kali ganda, tetapi nilai dengan cahaya itu masih jauh melebihi julat stafilokokus. Cas kationik membantu pewarna menghampiri membran luar, tetapi penembusan masih menjadi faktor pembatas. Formulasi, masa inkubasi dan pilihan derivatif lebih banyak mengubah angka ini berbanding menggunakan pewarna yang sama berulang kali pada dos lebih tinggi.

Enterokokus memberikan peringatan. Di bawah protokol terdahulu, E. faecalis langsung tidak menunjukkan kelebihan daripada cahaya, dan E. faecium yang rintang terhadap vankomisin memerlukan molekul yang berbeza, bukannya lebih banyak cahaya. Sesiapa yang memetik satu nilai MBC metilena biru sebagai pemalar antibakteria umum telah tersalah tafsir literatur. Pemalar sedemikian tidak wujud. Yang ada hanyalah nilai khusus mengikut strain, medium, inokulum, inkubasi, panjang gelombang dan fluens. Cara membaca nilai tersebut tanpa mengelirukan diri sendiri dibincangkan dalam panduan mentafsir lengkung pembunuhan.

Kulat: peka, tetapi peringkat dan pam menentukan hasil

Dinding kulat yang terdiri daripada glukan, manan dan kitin menimbulkan masalah pengambilan yang berbeza daripada bakteria, dan kulat juga mempunyai pertahanan aktif. Hasil efluks Candida di atas ialah contoh paling jelas: pewarna yang sama, cahaya yang sama, medium yang sama, namun strain yang mengekspresikan pam secara berlebihan terselamat, sedangkan strain induk kehilangan kira-kira 99.999 peratus unit pembentuk koloni. Dermatofit menambahkan faktor peringkat perkembangan. Spora jauh lebih mudah mati berbanding hifa, maka protokol yang menghapuskan spora masih boleh meninggalkan serpihan hifa yang berdaya hidup pada dos yang sama.

Itulah sebab laporan antikulat metilena biru memerlukan kawalan cahaya yang sama telitinya seperti laporan bakteria. Kajian klinikal fotodinamik kuku dan kulit menggabungkan pewarna 1 hingga 2 peratus dengan cahaya merah yang diukur pada fluens yang ditetapkan serta susulan, dan membezakan penampilan klinikal daripada penghapusan kulat yang disahkan secara mikologi. Percubaan tersebut diulas dalam ringkasan bukti fotodinamik kulat kuku dan kulit. Menyapu pewarna cair pada lesi di bawah cahaya bilik hanya menghasilkan semula warnanya tanpa melaksanakan prosedurnya.

Semakan biofilem: model oral 33 spesies

Kajian biofilem oral berbilang spesies 2024 wajar diberi perhatian kerana ia menguji keadaan yang sukar, bukannya yang mudah. Tiga puluh tiga spesies oral, termasuk Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium dan streptokokus oral, tumbuh secara anaerob menjadi biofilem matang pada hari 6. Rawatan menggunakan pewarna 0.01 peratus dengan LED 660 nm selama 5 minit pada irradians tinggi. Pewarna sahaja dan cahaya sahaja masing-masing mengurangkan jumlah kiraan dengan ketara, dan gabungannya mengurangkan aktiviti metabolik kira-kira separuh, namun komuniti itu tidak mengalami penstrukturan semula dan biofilem tersebut tidak disterilkan.

Itu ialah kesan sebenar dengan had yang dinyatakan secara jujur. Ia menyokong rawatan fotodinamik sebagai rawatan tambahan setempat dalam poket yang telah dibersihkan, bukannya sebagai bahan kumur yang dengan sendirinya merawat periodontitis yang telah didiagnosis. Ini membawa kita kepada jurang yang lebih umum.

Mengapa pembunuhan di makmal tidak sama dengan rawatan

Ujian MBC planktonik mendedahkan sel yang seragam kepada pewarna dan cahaya yang seragam dalam medium beroksigen. Lesi tidak menyediakan mana-mana keadaan itu. Matriks memperlahankan kemasukan, keadaan seperti sel persister mampu menahan pengoksidaan, darah dan eksudat menyerap cahaya, geometri tisu mewujudkan bayang-bayang, dan poket hipoksia melemahkan tindak balas kimia Jenis II kerana oksigen singlet, mengikut takrifnya, memerlukan oksigen molekul. Jangkitan campuran menambahkan spesies yang berbeza dari segi pengambilan dan kepekaan, maka satu nilai strain rujukan tidak dapat mewakili keseluruhan kawasan.

Contoh oral menjadikan jurang itu nyata. Mengurangkan Porphyromonas atau streptokokus dalam piring, atau menekan biofilem yang dikultur sebanyak separuh, tidak membuktikan bahawa bahan kumur biru merawat periodontitis, menyembuhkan jangkitan endodontik atau menghapuskan bakteremia. Penjagaan periodontal klinikal bergantung pada pemecahan dan penyingkiran biofilem secara mekanikal serta pengurusan anatomi poket, manakala rawatan berasaskan cahaya dikaji sebagai rawatan tambahan setempat. Kepekatan pewarna yang membunuh dalam telaga ujian tidak mempunyai hubungan tetap dengan kepekatan yang mencapai bakteria di bawah garis gusi, dan cahaya bilik bukan dos 660 nm. Penentuan dos, keselamatan dan batas interaksi untuk sebarang penggunaan oral perlu dikendalikan oleh klinisian, seperti yang dihuraikan dalam rujukan keselamatan dan interaksi.

Perkara yang tidak dibuktikan oleh bukti ini

Ini bukan dakwaan tentang disinfektan isi rumah. Jadual bakterisid menggunakan strain, medium, masa sentuhan, spektrum dan fluens yang ditetapkan. Ia tidak memberikan maklumat tentang permukaan dapur, masa sentuhan yang diperlukan apabila terdapat kotoran organik, atau piawaian disinfeksi kawal selia.

Ini juga bukan pengganti antibiotik sistemik. Tindakan fotodinamik konvensional memerlukan pewarna, cahaya yang diserap dan oksigen di tempat yang sama pada masa yang sama. Cahaya tidak mencapai kawasan yang dalam atau tersebar seperti ubat yang ditelan mencapai darah. Literatur meletakkan pendekatan ini untuk jangkitan setempat yang boleh dicapai atau sebagai rawatan tambahan, sama seperti Wainwright menghuraikan disinfeksi setempat sejak awal.

Rumusan yang wajar adalah lebih terbatas, tetapi masih menarik. Metilena biru mempunyai aktiviti antimikrob sederhana dalam gelap, dan cahaya merah mencetuskan kesan fotodinamik yang jauh lebih besar bagi banyak bakteria dan kulat, dengan nisbah perbezaan besar antara keadaan bercahaya dan gelap seperti 500 kepada 25 uM bagi Pseudomonas dan 80 kepada 20 uM bagi MRSA epidemik, di samping kegagalan yang memberikan pengajaran pada enterokokus dan Candida yang mempunyai keupayaan efluks. Penerapan kepada rawatan ditentukan oleh penghantaran, fisiologi biofilem dan oksigen sama seperti kepekatan nominal pewarna. Nyatakan keadaan-keadaan itu dengan jelas, dan angka tersebut membawa makna. Ketepikan keadaan itu, dan angka tersebut tidak bermakna.