Mengukur kesan metilena biru pada mitokondria: oksigen, ATP dan keupayaan membran

Katakan sebuah makmal menambahkan metilena biru pada mitokondria yang mengalami gangguan respirasi dan melihat penggunaan oksigen meningkat. Ayat yang lazimnya ditulis ialah pewarna itu memulihkan fungsi mitokondria. Ayat itu mungkin salah. Fluks oksigen, sintesis ATP dan keupayaan membran ialah tiga konsep yang berbeza. Ketiga-tiganya berkongsi organel yang sama sebagaimana sandaran, penyegerakan dan perkongsian berkongsi folder awan yang sama: saling berkaitan, tetapi tertakluk pada aturan yang berbeza. Jika satu konsep disalah anggap sebagai konsep yang lain, tafsirannya gagal, walaupun setiap pengukuran betul dari segi teknikal.

Metilena biru mudah menimbulkan kekeliruan ini kerana ia turut terlibat dalam sistem yang diukurnya. Ia menjalani kitaran redoks dengan menerima elektron di bahagian hulu dan mendermakannya di bahagian hilir, merupakan kation lipofilik yang terkumpul dalam mitokondria bertenaga, dan merupakan sebatian biru pekat yang menyerap serta memancarkan cahaya dalam jalur yang sama seperti prob lazim. Satu bacaan sahaja tidak mampu merangkumi semua ini. Pendekatan yang boleh dipercayai, seperti yang ditunjukkan dalam kajian mitokondria Budapest, ialah mengukur fluks oksigen bersama kadar sintesis ATP, keupayaan membran dan pelepasan hidrogen peroksida, dengan kawalan khusus untuk pewarna pada setiap langkah.

Respirometri mengukur fluks oksigen, bukan output tenaga

Respirometri beresolusi tinggi, sama ada menggunakan Oroboros Oxygraph atau penganalisis fluks ekstrasel Seahorse, melaporkan satu perkara: seberapa cepat oksigen diturunkan. Ia tidak melaporkan bilangan proton yang dipam bagi setiap elektron, berapa banyak kecerunan yang dikekalkan, atau sama ada ATP sintase menggunakannya.

Istilah yang digunakan penting. Dalam mitokondria terasing, substrat tanpa ADP menghasilkan respirasi kebocoran, substrat dengan ADP pada tahap tepu menghasilkan kapasiti fosforilasi oksidatif, dan pentitratan agen penyahganding menghasilkan kapasiti pemindahan elektron maksimum. Dalam sel utuh, padanan Seahorse ialah respirasi basal, respirasi berkaitan ATP yang sensitif terhadap oligomisin, kebocoran proton, respirasi maksimum yang ditentukan oleh FCCP, dan penggunaan oksigen bukan mitokondria yang tahan terhadap rotenon bersama antimisin. Menamakan output Seahorse sebagai Keadaan 3 dan Keadaan 4 memberikan gambaran ketepatan yang tidak disokong oleh sediaan tersebut, seperti yang dijelaskan oleh kerangka Mito Stress Test Agilent.

Metilena biru memutuskan kaitan intuitif antara lebih banyak oksigen dengan lebih banyak tenaga. Dalam mitokondria otak marmut terasing, pewarna pada 100 nM hingga 1 uM meningkatkan penggunaan oksigen semasa rehat dengan substrat glutamat bersama malat, suksinat dan alfa-gliserofosfat, dengan peningkatan kira-kira 64 peratus pada alfa-gliserofosfat. Namun, respirasi yang dirangsang ADP dalam mitokondria sihat pada asasnya tidak berubah, menurut kajian mitokondria otak terasing. Oleh sebab kebocoran meningkat sementara fluks yang dirangsang ADP kekal mendatar, nisbah kawalan respirasi yang dikira menurun. Penurunan itu tidak bermakna pewarna tersebut merosakkan mitokondria. Ia bermakna pewarna itu menambahkan kitaran redoks yang menggunakan oksigen di samping respirasi biasa. Asai penggunaan oksigen metilena biru yang hanya melaporkan peningkatan itu telah mengukur proses kimia sebenar, tetapi tidak memberikan maklumat tentang pemuliharaan tenaga.

Eksperimen pemulihan menunjukkan jurang yang sama pada skala lebih besar. Apabila Kompleks I disekat, fluks oksigen pulih kira-kira tiga kali ganda, manakala sintesis ATP pulih hanya kira-kira 1.5 kali ganda. Lebih banyak oksigen sampai ke elektrod. Bahagian yang menyumbang kepada penghasilan ATP lebih kecil. Sebarang dakwaan peningkatan fosforilasi oksidatif memerlukan data ATP juga, sebaik-baiknya dinyatakan sebagai nisbah ATP bagi setiap oksigen dengan konvensyen penyebut dijelaskan.

Asai ATP mengukur kadar sintesis, yang tidak boleh digantikan dengan kandungan

Asai ATP menjawab soalan yang berbeza: berapa banyak ATP dijana bagi setiap unit masa. Bacaan kinetik, sama ada luminesens lusiferase kelip-kelip yang dijejak selama beberapa minit atau asai bergandingan heksokinase bersama glukosa-6-fosfat dehidrogenase yang dibaca pada 340 nm, menghasilkan kadar. Pengukuran tunggal jumlah ATP pada titik akhir menghasilkan kandungan, yang mencerminkan sintesis ditolak penggunaan dan dengan sendirinya memberikan sedikit maklumat tentang fosforilasi oksidatif.

Kumpulan Budapest menggunakan kaedah enzimatik bergandingan dengan adenilat kinase direncat, dan mendapati bahawa metilena biru pada 1 hingga 2 uM meningkatkan penghasilan ATP secara sederhana tetapi signifikan dalam mitokondria yang dirawat dengan rotenon dan antimisin. Pemulihan itu nyata, tetapi separa. Kajian ketoksikan TEGDMA memperoleh corak jawapan yang sama dalam model berbeza: monomer pergigian TEGDMA pada 5 mM menurunkan respirasi berkaitan Kompleks I dengan mendadak daripada kira-kira 286 kepada 28 unit fluks, dan pewarna pada 2 uM memulihkannya kepada kira-kira 86.

Dua kawalan wajib dilakukan apabila menggunakan sebatian redoks berwarna. Pertama, gunakan oligomisin untuk menentukan berapa banyak sintesis ATP yang diukur bergantung pada ATP sintase. Kedua, jalankan ujian pemulihan penambahan piawai tanpa sel dengan ATP yang diketahui jumlahnya, reagen lengkap dan kepekatan pewarna yang tepat seperti yang digunakan, sekurang-kurangnya 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM dan 2 uM. Pewarna boleh menyerap cahaya yang dipancarkan, merencat enzim pelapor atau mengubah kimia redoks reagen, dan panduan umum asai lusiferase mengesyorkan saringan balas biokimia khusus untuk jenis gangguan ini. Jangan anggap 1 uM bebas daripada artifak hanya kerana pelindapan biasanya lebih teruk pada kepekatan yang lebih tinggi.

Prob keupayaan membran mengukur taburan pewarna, bukan fluks

Safranin O, TMRM dan TMRE, rodamin 123 serta JC-1 semuanya ialah kation yang boleh merentasi membran. Kation ini terkumpul dalam matriks bercas negatif mengikut keseimbangan elektrokimia, maka pendarfluor keseluruhan melaporkan keupayaan secara tidak langsung melalui lokasi prob. Tiada satu pun mengukur ATP atau fluks elektron.

Setiap prob mempunyai sediaan yang paling sesuai. Safranin O sesuai untuk mitokondria terasing dan sel yang ditelapkan, lazimnya sekitar 2 uM dengan pengujaan sekitar 495 nm dan pancaran sekitar 585 nm, beroperasi dalam rejim pelindapan apabila pengambilan prob mengubah pendarfluor keseluruhan. TMRM dan TMRE sesuai untuk sel utuh pada pemuatan nanomolar rendah dalam mod tanpa pelindapan, apabila penyahkutuban melepaskan pewarna dan pendarfluor mitokondria menurun; pada pemuatan tinggi, arah isyarat boleh berbalik akibat pelindapan kendiri. JC-1 memberikan nisbah hijau kepada merah yang mudah digunakan, tetapi bergantung pada pemuatan dan jisim mitokondria, menjadikannya kurang sesuai untuk kerja kuantitatif berbanding TMRM yang dikawal dengan teliti. Kompromi ini diringkaskan dalam ulasan prob keupayaan membran mitokondria yang digunakan secara meluas.

Metilena biru menyebabkan gangguan optik tepat pada kepekatan kerja. Jalur penyerapannya sekitar 600 hingga 665 nm bertindih dengan pancaran merah prob, maka kesan penapis dalaman, pelindapan dan penyerapan cahaya pengujaan semuanya munasabah. Pewarna itu juga merupakan kation lipofilik kedua yang taburannya sendiri berubah mengikut keupayaan yang sedang diukur. Langkah perlindungannya ialah pengukuran berlebihan bersama sampel kosong: prob sahaja, pewarna sahaja, prob bersama setiap kepekatan pewarna, penyahkutuban penuh dengan FCCP sebagai rujukan sifar, dan sebaik-baiknya prob kedua yang berbeza dari segi optik. Kajian pintasan Kompleks III memberikan contoh pendekatan ini dengan mengulangi pemulihan keupayaan membran menggunakan kedua-dua safranin O dan TMRM selepas perencatan oleh antimisin dan miksotiazol, lalu memperoleh pemulihan kualitatif yang sama. Satu pelapor optik ialah petunjuk. Dua pelapor bebas ialah bukti.

Tiga sediaan, tiga soalan berbeza

Mitokondria terasing, sel yang ditelapkan dan sel utuh bukan tetapan kepekaan yang boleh ditukar ganti pada satu asai. Ketiga-tiganya ialah konsep berbeza dengan prinsip operasi berbeza.

Mitokondria terasing mengekalkan rantai pengangkutan elektron, membran dalaman dan jentera matriks sambil menyingkirkan membran plasma, sitosol dan seni bina rangkaian. Penyingkiran itulah tujuannya: substrat, ADP, perencat dan kepekatan pewarna ditentukan dengan tepat, membolehkan laluan dikenal pasti. Kekurangannya ialah kehilangan bekalan substrat asal, pengisyaratan dan permintaan.

Sel yang ditelapkan mengekalkan mitokondria dalam sebahagian besar seni bina selnya sambil membenarkan substrat eksogen dan ADP melalui membran plasma yang telah dibuka. Sediaan ini ialah alat yang sesuai untuk mengenal pasti kecacatan laluan substrat dalam konteks sel. Penelapan berlebihan merosakkan membran luar, dan kawal atur sitosol hilang akibat pembasuhan.

Sel utuh mengekalkan semuanya: penghalang membran plasma, agen penurun sitosol, pengangkutan substrat endogen, rangkaian mitokondria dan permintaan ATP. Sediaan ini paling hampir dengan fisiologi dan paling jauh daripada mekanisme, kerana pengambilan, penurunan dan pengasingan pewarna semuanya membentuk pendedahan berkesan mitokondria.

Kajian TEGDMA sengaja menggunakan ketiga-tiga peringkat: mitokondria otak terasing untuk pemulihan pengoksidaan dan keupayaan oleh pewarna, sel stem pulpa gigi yang ditelapkan terutamanya untuk menentukan bahawa kerosakan terletak pada pengoksidaan substrat berkaitan Kompleks I, dan sel stem utuh untuk kesan bersih fisiologi pewarna pada 2 uM terhadap penggunaan oksigen yang ditindas. Bagi pembaca yang membandingkan bacaan mitokondria merentas sediaan, artikel penerangan iringan tentang cara metilena biru menggerakkan elektron melalui rantai respirasi memberikan latar belakang laluan, manakala panduan membaca kajian respirasi metilena biru menerangkan logik dos dan perencat.

Kawalan yang diperlukan oleh pewarna aktif redoks

Sebatian yang menjalani kitaran redoks memerlukan senarai kawalan yang lebih panjang berbanding perencat biasa, kerana proses kimia pewarna sahaja boleh menyerupai proses biologi.

Untuk respirometri, jalankan kebuk yang mengandungi penimbal sahaja bagi mengukur hanyutan, kebuk penimbal bersama pewarna tanpa bahan biologi, pewarna bersama sebarang agen penurun ekstrasel yang hadir dalam asai, dan rotenon bersama antimisin pada akhir ujian untuk menentukan penggunaan oksigen bukan mitokondria dalam sel utuh. Perhatikan bahawa pewarna yang diturunkan teroksida semula dengan memindahkan elektron kepada oksigen untuk membentuk hidrogen peroksida. Oleh itu, sampel kosong pewarna sahaja tanpa penderma elektron akan menganggarkan terlalu rendah penggunaan oksigen tanpa sel yang berlaku apabila NADH atau NADPH tersedia.

Untuk hidrogen peroksida, utamakan Amplex UltraRed yang ditentukur bersama peroksidase lobak kuda berbanding pewarna DCFDA tidak selektif, sahkan dengan katalase, dan uji kebergantungan pada pencahayaan, kerana pewarna itu ialah pemeka cahaya. Kajian mitokondria otak mendapati beban peroksida meningkat lebih daripada empat kali ganda pada kepekatan pewarna serendah 100 nM sementara penyingkirannya menjadi lebih perlahan, dengan peroksida terbentuk secara langsung oleh pewarna yang diturunkan tanpa perantara superoksida. Butiran pemilihan prob dan kawalan cahaya terdapat dalam artikel iringan tentang mengukur spesies oksigen reaktif dalam eksperimen pewarna, dan persoalan lebih luas tentang bila peroksida bertindak sebagai isyarat berbanding beban dibincangkan bersama keseimbangan redoks sel dan dakwaan antioksidan.

Untuk dakwaan tentang laluan, uji kedua-dua tapak perencatan Kompleks III: antimisin A pada tapak Qi dan miksotiazol pada tapak Qo, serta titik akhir Kompleks IV dengan sianida. Kajian otak tikus terdahulu melaporkan pemulihan oleh pewarna bagi respirasi yang disekat rotenon tetapi bukan yang disekat antimisin, manakala kajian tiga spesies yang kemudian mendapati pemulihan separa dengan kedua-dua perencat serta bukti penurunan sitokrom c secara langsung. Anggap pintasan itu selaras dengan data yang lebih baharu, bukannya telah dipastikan, kerana kepekatan pewarna, tapak perencat, keadaan substrat dan taburan pewarna semuanya mengubah laluan yang diperhatikan.

Matriks pemilihan asai

Gunakan jadual ini untuk memilih pengukuran berdasarkan soalan, bukan sebaliknya.

Dakwaan minimum yang meyakinkan memerlukan kepekatan pewarna yang sama, 100 nM, 300 nM, 1 uM dan 2 uM, diuji melalui fluks oksigen dalam keadaan kebocoran, ADP, oligomisin dan agen penyahganding; kadar sintesis ATP; keupayaan membran dengan sebaik-baiknya dua prob; serta pelepasan peroksida yang ditentukur dengan kawalan katalase dan tanpa sel. Laporkan set yang saling berkaitan: fluks oksigen bersama kadar ATP, ATP bagi setiap oksigen, keupayaan dan peroksida. Mana-mana satu daripada nilai itu, jika berdiri sendiri, hanyalah pengukuran yang masih mencari makna.