Mengapa metilena biru digunakan sebagai pewarna balas tahan asid

Seorang juruteknik memeriksa calitan kahak selepas keseluruhan urutan pewarnaan selesai. Bakteria berbentuk rod merah jelas kelihatan pada medan biru, lalu laporan dikeluarkan dengan menyatakan bahawa basil tahan asid dilihat. Keesokan harinya, slaid lain menunjukkan medan biru yang seragam tanpa rod merah, lalu dilaporkan sebagai negatif untuk tuberkulosis. Salah satu laporan ini membuat kesimpulan yang melampaui bukti pada slaid, dan laporan itu bukan yang pertama.

Kekeliruan ini berpunca daripada pemahaman konsep. Juruteknik tersebut menganggap pewarna biru sebagai sebahagian daripada kimia pengesanan, seolah-olah metilena biru membantu mencari mikobakteria. Hakikatnya, tidak. Ketika metilena biru menyentuh slaid, ujian itu sudah pun selesai. Pewarna ini hanya mewarnai latar belakang supaya hasilnya dapat dibaca. Artikel ini menerangkan tujuan metilena biru dalam pewarnaan tahan asid, mengapa warna biru digunakan dan bukannya warna lain, serta kesimpulan yang boleh dibuat daripada warna merah pada latar biru.

Jawapan ringkas

Pewarnaan tahan asid ialah ujian pembezaan yang berasaskan tiga idea. Karbol fuksin, pewarna primer, dipaksa masuk ke dalam setiap sel termasuk mikobakteria berdinding berlilin. Asid-alkohol, bahan penyahwarna, menanggalkan pewarna merah daripada sel biasa tetapi gagal mengeluarkannya daripada sel tahan asid. Metilena biru, pewarna balas, kemudian mewarnai semua bahan yang telah dinyahwarnakan, supaya sel bukan tahan asid, sel perumah dan serpihan kelihatan biru manakala basil tahan asid kekal merah. Pewarna balas memberikan kontras. Ia tidak memainkan sebarang peranan dalam kimia yang menjadikan sesuatu sel tahan asid.

Fungsi setiap langkah

Rajah di bawah menunjukkan pembahagian peranan. Baca dari kiri ke kanan sebagai urutan prosedur, dan baca jalur bawah sebagai peringatan bahawa setiap kumpulan kaedah pewarnaan menjawab soalan yang berbeza.

Penembusan berlaku dahulu. Mikobakteria menahan pewarna berair biasa kerana selubungnya sangat hidrofobik, maka protokol memaksa pewarna masuk. Dalam kaedah Ziehl-Neelsen, pemanasan hingga berwap mendorong karbol fuksin yang mengandungi fenol menembusi dinding berlilin. Dalam kaedah sejuk Kinyoun, haba digantikan dengan formulasi pewarna primer yang jauh lebih pekat, dan beberapa versi tanpa haba yang diubah suai menambahkan surfaktan. Protokol pewarnaan tahan asid American Society for Microbiology mendokumentasikan kedua-dua formulasi secara bersebelahan, dan perbezaan kepekatannya ketara: kira-kira 0.3 g fuksin bes bagi setiap 100 mL untuk kaedah pemanasan berbanding kira-kira 4 g untuk kaedah sejuk.

Pembezaan berlaku selepas itu. Asid-alkohol, lazimnya 3 mL asid hidroklorik pekat dalam 97 mL etanol 95 peratus, membasuh keluar pewarna merah daripada setiap sel yang dindingnya tidak mempunyai ketahanan khas. Sel dengan selubung lipid mikobakteria yang utuh mengekalkan pewarna tersebut. Inilah langkah yang menjadi asas keseluruhan kaedah, dan langkah yang paling sensitif terhadap teknik, seperti yang dibincangkan di bawah.

Kontras dihasilkan pada langkah terakhir. Slaid kini mengandungi sel tahan asid merah pada latar belakang sel yang telah dinyahwarnakan dan hampir tidak berwarna. Metilena biru pada 0.3 peratus w/v menjadikan latar belakang itu kelihatan semula dengan warna yang sangat berbeza daripada merah. Pewarnaan balas dilakukan seketika, lazimnya 20 hingga 30 saat dalam kaedah pemanasan dan sehingga beberapa minit dalam sesetengah varian kaedah sejuk. Tempohnya bergantung pada protokol, bukan sifat pewarna itu sendiri.

Mengapa pewarna ini, dan mengapa biru

Metilena biru ialah pewarna bes kationik, yang bermaksud ion berwarnanya membawa cas positif dan mengikat permukaan bercas negatif pada bakteria yang telah dinyahwarnakan, sel perumah dan serpihan. OpenStax Microbiology menerangkan prinsip cas ini sebagai asas umum pewarna bes. Namun, metilena biru bukanlah satu-satunya pewarna yang sesuai dari segi kimia dalam konteks ini. Kristal ungu dan safranin juga merupakan pewarna bes. Pemilihannya berdasarkan optik, bukan kimia.

Rod merah memerlukan latar belakang dengan rona yang berkontras, dan biru memberikan perbezaan paling berguna daripada merah untuk mikroskopi medan cerah. Safranin tidak sesuai sebagai pewarna balas kerana warna akhir merah jambunya terlalu hampir dengan karbol fuksin yang dikekalkan, sekali gus menghapuskan perbezaan yang dihasilkan oleh prosedur tersebut. Kristal ungu pula akan menghasilkan latar belakang ungu gelap yang bersaing dengan basil merah halus untuk menarik perhatian. Bukti paling kukuh bahawa tugasnya ialah menghasilkan kontras dan bukannya melibatkan kimia ialah kebolehan menggantikannya: pewarna balas hijau seperti hijau malakit dan hijau berlian digunakan dalam sesetengah protokol veterinar dan protokol yang diubah suai, dan ujian itu masih berfungsi kerana sebarang rona yang jelas berbeza menjalankan tugas yang sama.

Dua implikasi praktikal menyusul. Pertama, resipi standard tidak menetapkan sebarang pelarasan pH; jangan kelirukan larutan berair biasa 0.3 peratus ini dengan formulasi beralkali seperti metilena biru Loeffler, yang tergolong dalam konsep pewarnaan berbeza. Kedua, penggunaan berlebihan menjejaskan hasil. Literatur histologi secara khusus memberi amaran bahawa latar belakang biru yang terlalu pekat boleh menyembunyikan basil yang sedikit, maka membiarkan pewarna menutupi slaid lebih lama daripada tempoh yang dibenarkan protokol mengurangkan kebolehbacaan tanpa sebarang manfaat.

Kimia dinding yang membolehkan ujian ini dilakukan

Keupayaan asid-alkohol membezakan sel berpunca daripada selubung mikobakteria. Teras strukturnya ialah kompleks mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikan yang dihubungkan dengan arabinogalaktan, dengan hujung luarnya membawa asid mikolik berantai sangat panjang, lalu membentuk mikomembran luar yang kaya lipid dan mempunyai kebolehtelapan yang sangat rendah. Ulasan tentang membran luar mikobakteria memperincikan seni bina ini. Penghalang tersebut berfungsi dalam kedua-dua arah. Ia menghalang kemasukan pewarna, sebab itulah penembusan memerlukan haba atau pewarna primer yang lebih kuat, dan ia menghalang pengekstrakan pewarna, sebab itulah asid-alkohol gagal menyingkirkan karbol fuksin setelah pewarna itu berada di dalam sel. Bakteria biasa tidak mempunyai selubung ini dan kehilangan pewarna tersebut. Oleh itu, sifat tahan asid paling tepat difahami sebagai fenomena penghalang lipid, bukannya pengikatan kimia fuksin kepada asid mikolik.

Kimia ini juga menjelaskan persoalan yang sering timbul: mikobakteria sukar diwarnai dengan kaedah Gram dan hasilnya tidak menentu, kadangkala kelihatan sebagai bentuk samar seperti manik atau bayang sel yang tidak berwarna. Dinding hidrofobiknya mengehadkan penembusan kristal ungu. Pewarnaan tahan asid bukanlah pewarnaan Gram yang diubah suai. Ia menggunakan prinsip pembezaan lain yang berasaskan sifat dinding yang berbeza, sebagaimana ditunjukkan bagi dua kaedah yang lain dalam perbandingan pewarnaan ringkas dengan pewarnaan Gram.

Tiga kaedah, tiga soalan

Untuk kumpulan kaedah bakteria satu pewarna yang lebih luas, lihat atlas pewarnaan mikroskopi.

Perkara yang tidak dapat dibuktikan oleh warna merah pada latar biru

Rod merah bermaksud organisma tersebut mengekalkan karbol fuksin ketika terdedah kepada asid-alkohol. Penemuan itu konsisten dengan Mycobacterium tuberculosis, tetapi panduan diagnosis tuberkulosis CDC menyatakan dengan jelas bahawa mikobakteria lain juga tahan asid, maka pengenalpastian spesies memerlukan kultur dan ujian asid nukleik, bukan warna.

Kesilapan teknik tertumpu pada dua langkah pembasuhan. Penyahwarnaan yang tidak mencukupi meninggalkan bahan latar belakang berwarna merah dan boleh menyebabkan bacaan positif palsu. Penyahwarnaan berlebihan menanggalkan pewarna primer yang dikekalkan dengan lemah dan menyumbang kepada hasil negatif palsu. Pewarna balas yang digunakan secara berlebihan menyembunyikan basil yang sedikit dalam warna biru. Calitan tebal, reagen yang termendak dan air bilasan tercemar turut menghasilkan artifak masing-masing.

Kepekaan dibatasi oleh jumlah organisma walau seteliti mana pun tekniknya. Mikroskopi calitan konvensional memerlukan kira-kira 5,000 hingga 10,000 basil bagi setiap mililiter kahak, dan ulasan bukti CDC terdahulu meletakkan kepekaan calitan pada sekitar 45 hingga 80 peratus dalam kalangan kes pulmonari yang disahkan melalui kultur. Oleh itu, calitan negatif tidak sekali-kali menolak kemungkinan tuberkulosis. Panduan CDC semasa mengekalkan kultur bersama setiap calitan dan mengesyorkan ujian amplifikasi asid nukleik pada sekurang-kurangnya satu spesimen pernafasan apabila tuberkulosis pulmonari dipertimbangkan dan hasilnya akan mengubah pengurusan kes.

Kerja praktikal mesti mengikut protokol yang dibenarkan

Penerangan untuk pengajaran, termasuk artikel ini, tidak memberikan kebenaran untuk menjalankan kerja klinikal. Untuk kerja di makmal, ikuti prosedur operasi standard makmal yang telah disahkan dan selaras dengan dokumen CDC, APHL atau CLSI semasa; rujukan pewarnaan tahan asid CDC yang disimpan dalam arkib Stacks menunjukkan cara prosedur sedemikian menetapkan reagen dan bacaan hasil. Kerja dengan spesimen tuberkulosis memerlukan pembendungan: calitan disediakan di dalam kabinet keselamatan biologi kerana penyediaannya menghasilkan aerosol dan percikan, dan panduan keselamatan makmal CDC menyatakan bahawa calitan yang telah difiksasi dengan haba sekalipun mungkin mengandungi basil tuberkel yang masih hidup dan tetap perlu dikendalikan sebagai bahan tercemar. Entri CDC Public Health Image Library bagi calitan karbol fuksin dan metilena biru yang diperiksa untuk M. leprae mengingatkan kita bahawa skop kaedah ini melangkaui tuberkulosis: kontras merah pada biru yang sama digunakan di mana-mana organisma tahan asid dicari, dan bacaan negatif yang dibuat dengan teliti juga merupakan hasil yang wajar direkodkan.

Membaca slaid yang telah siap

Pewarna balas menunjukkan kegunaannya semasa saringan. Ahli mikroskopi yang mengimbas pada pembesaran rendah mula-mula menggunakan latar belakang biru untuk menilai kualiti calitan: taburan sel yang sekata, sel perumah yang utuh untuk pemfokusan, dan tiada mendakan yang banyak. Struktur merah yang disyaki kemudian menarik perhatian tepat kerana tiada bahan lain pada slaid yang berwarna merah. Pengesahan dilakukan menggunakan imersi minyak, apabila basil sebenar menunjukkan bentuk rod halus yang dijangka, kadangkala sedikit melengkung atau seperti manik, dan bukannya serpihan pewarna yang seragam.

Pewarnaan latar belakang juga menentukan istilah yang digunakan dalam laporan. Slaid dengan basil merah dilaporkan sebagai basil tahan asid dilihat, selalunya dengan gred semikuantitatif mengikut skala makmal. Slaid tanpa organisma merah dilaporkan sebagai tiada basil tahan asid dilihat, bukan sekali-kali sebagai negatif untuk tuberkulosis. Perbezaan ini penting kerana medan biru membuktikan bahawa pewarnaan berfungsi, sel menyerap pewarna balas dan sistem optik memadai, tetapi tidak memberikan sebarang maklumat tentang organisma yang berada di bawah had pengesanan. Medan biru kosong ialah hasil yang sah tentang slaid, bukan keputusan tentang pesakit.

Ingat pembahagian peranan ini, dan laporan akan mudah ditulis. Karbol fuksin mengesan organisma yang disyaki. Asid-alkohol menjalankan ujian. Metilena biru hanya menjadikan jawapannya mudah dibaca: merah mengekalkan pewarna ketika terdedah kepada asid, biru kehilangannya. Segala yang lain, termasuk spesies, jumlah organisma dan makna klinikal, diperoleh daripada kerja di luar pemeriksaan slaid.