Metilena biru sebagai penunjuk anaerob dan oksigen: perkara yang dibuktikan oleh perubahan warna

Seorang juruteknik menutup rapat balang anaerob, memeriksa jalur penunjuk metilena biru melalui penutup, lalu melihat apa yang diharapkannya. Jalur itu telah berubah daripada biru kepada putih. Dia merekodkan ujian itu sebagai anaerob dan meneruskan kerja. Dua hari kemudian, satu plat tidak menunjukkan sebarang pertumbuhan manakala satu tiub kaldu tertutup rapat di dalam balang yang sama menunjukkan tanda pendedahan kepada oksigen. Jalur itu memberikan maklumat yang benar. Dia mengajukan soalan yang salah kepadanya.

Kekeliruan ini berpunca daripada pemahaman konsep. Penunjuk anaerob metilena biru berasaskan konsep redoks, bukan konsep kesterilan atau konsep pengesahan keseluruhan sistem. Apabila perbezaan itu jelas, jalur tersebut menjadi alat yang tepat dan boleh dipercayai dengan tugas yang khusus.

Konsep: pasangan redoks boleh balik

Metilena biru terlarut wujud dalam dua keadaan. Bentuk teroksida ialah kation biru yang biasa dikenali. Bentuk terturun, yang dipanggil leukometilena biru, tidak berwarna. Pada pH hampir neutral, setengah tindak balas yang dipermudah melibatkan satu kation biru ditambah satu proton dan dua elektron, menghasilkan satu molekul leuko yang tidak berwarna. Keupayaan formalnya hampir tambah 11 milivolt berbanding elektrod hidrogen piawai pada pH 7, yang meletakkannya dalam julat yang boleh dicapai oleh banyak sistem penurun dan yang boleh diterbalikkan oleh oksigen.

Penurunan memerlukan keupayaan redoks setempat yang rendah. Penyingkiran oksigen sahaja tidak semestinya mencukupi. Kajian awal tentang keadaan anaerob mendapati bahawa metilena biru dalam air biasa tanpa oksigen mengekalkan warnanya kecuali jika terdapat bahan penurun, dan bahawa campuran kaldu dekstrosa dengan kira-kira 0.01 peratus pewarna mudah kehilangan warna pada 37 C, manakala campuran yang sama pada 4 C kekal biru selama sehari, seperti yang dilaporkan dalam eksperimen tentang tisu segar dan keadaan kultur anaerob. Suhu, pH, glukosa, askorbat, tioglikolat dan aktiviti penurunan oleh mikrob semuanya menentukan sama ada elektron tersedia.

Pengoksidaan semula hanya memerlukan oksigen. Apabila udara mencapai bentuk leuko, bentuk itu bertukar kembali menjadi biru. Penunjuk moden yang direka bentuk memanfaatkan kitaran ini: pewarna bersama bahan penurun dan matriks penstabil, tidak berwarna apabila oksigen rendah dan kembali biru apabila terdedah kepada udara, seperti yang ditunjukkan dalam penunjuk oksigen metilena biru hibrid berasaskan pewarna, bahan penurun, surfaktan dan tanah liat. Prototaip itu menggunakan pewarna 0.01 milimolar dengan askorbat atau glukosa 2.0 milimolar pada pH 11, menjadi tidak berwarna pada sekitar 0.5 peratus isi padu oksigen, dan membezakan paras oksigen di bawah 0.1 peratus daripada paras melebihi 0.5 peratus dalam kebuk ujiannya.

Jadi, prinsip operasinya mudah. Biru bermaksud zon penunjuk berada dalam keadaan teroksida. Tidak berwarna bermaksud zon penunjuk telah mencapai keadaan menurun dengan oksigen rendah. Perubahan itu boleh balik, bersifat setempat dan bersifat kimia. Dengan sendirinya, ia tidak memberikan sebarang maklumat tentang mikrob.

Cara jalur penunjuk metilena biru berfungsi dalam balang anaerob

Jalur penunjuk metilena biru untuk balang anaerob ialah zon tindak balas kecil yang diletakkan dalam atmosfera balang supaya boleh dilihat tanpa membuka bekas. Format komersial berbeza-beza: jalur kertas, tablet yang dilarutkan atau dibasahkan semasa persediaan, dan kertas hibrid yang lebih baharu. Sesetengahnya memerlukan satu titis air suling untuk mengaktifkan zon tindak balas. Yang lain ialah peranti format kering yang mesti kekal kering. Helaian arahan produk tertentu mesti diikuti kerana penghidratan, kedudukan dan masa bacaan merupakan sebahagian daripada kimianya.

Dalam amalan, bacaan yang dimaksudkan mempunyai dua kemungkinan. Biru bermaksud oksigen atau keadaan yang tidak cukup menurun masih wujud pada jalur. Putih atau tidak berwarna bermaksud keadaan redoks anaerob telah terbentuk pada jalur. Sesetengah kertas komersial menambahkan pigmen latar merah, jadi titik akhir terturunnya kelihatan merah jambu dan bukannya putih. Ketahui titik akhir yang dinyatakan untuk produk anda sebelum menilainya.

Masa yang diperlukan berbeza mengikut sistem. Dalam satu persediaan jenis GasPak, pemudaran bermula dalam kira-kira sejam dan selesai dalam beberapa jam, manakala perbandingan terkawal pada suhu bilik memerlukan lebih daripada enam jam untuk metilena biru. Keupayaan redoks medium dalam kajian itu mencapai kira-kira tolak 100 milivolt dalam masa 60 hingga 100 minit, jauh sebelum pewarna selesai berubah, dan berada jauh di bawah tolak 200 milivolt apabila jalur menjadi tidak berwarna sepenuhnya. Tindak balas penunjuk ketinggalan berbanding perubahan atmosfera. Jalur biru pada jam pertama tidak membuktikan kegagalan, dan jalur putih pada jam keenam menggambarkan keadaan jalur pada jam keenam.

Kedudukan juga penting atas sebab yang sama. Letakkan jalur dalam ruang udara di atas kandungan balang, supaya kelihatan melalui penutup, jauh daripada permukaan agar dan medium kultur. Jalur melaporkan keadaan persekitaran terdekatnya. Jika jalur diletakkan rata pada dinding sejuk, tertimbus di bawah plat atau dibiarkan basah oleh kondensat, ia melaporkan keadaan persekitaran mikro itu dan bukannya keadaan balang.

Perkara yang ditunjukkan oleh jalur dan yang tidak ditunjukkannya

Anggap penunjuk metilena biru dalam balang anaerob sebagai satu penderia di satu lokasi. Ia mengesahkan keadaan redoks dan oksigen setempat pada zon tindak balasnya sendiri, yang secara umum mewakili ruang udara jika pencampuran dan pengimbangan mencukupi. Segala kesimpulan di luar itu ialah inferens, dan inferens memerlukan bukti berasingan.

Jalur yang tidak berwarna tidak mengesahkan kesterilan. Kesterilan ialah ketiadaan organisma berdaya hidup, yang dibuktikan melalui pensterilan yang disahkan dan kawalan pengesahan kultur. Balang boleh berada dalam keadaan anaerob sepenuhnya tetapi masih tercemar, atau steril sepenuhnya tetapi masih aerob.

Jalur tidak mengesahkan setiap bahagian sistem kultur. Oksigen terlarut di dalam tiub tertutup rapat, oksigen yang terperangkap dalam agar yang dalam, kecerunan dalam balang yang padat dan kebocoran yang berlaku selepas bacaan semuanya tidak dapat dikesan oleh satu jalur. Eksperimen ruang menunjukkan zon biru dan tidak berwarna bersebelahan dalam bekas yang sama apabila penembusan oksigen dan aktiviti penurunan mencapai keseimbangan yang berbeza. Satu titik tidak dapat mengesahkan keadaan seluruh isi padu.

Jalur tidak membuktikan keadaan anaerob yang berterusan tanpa gangguan. Jalur yang dibaca sekali semasa persediaan tidak memberikan maklumat tentang jam kedua puluh. Kajian terkini tentang kualiti keadaan anaerob mengingatkan bahawa penunjuk kimia menggambarkan atmosfera pada saat ia dibaca dan boleh kelihatan memuaskan walaupun masih terdapat sedikit baki oksigen. Dokumentasi berterusan atau pada titik semakan, bukan satu pandangan sepintas lalu pada titik akhir, yang menghubungkan bacaan jalur dengan tempoh inkubasi.

Untuk penjelasan kimia berkaitan perubahan warna, lihat cara metilena biru berkitar antara keadaan teroksida dan terturun. Untuk memahami pengaruh oksigen terhadap pengendalian sampel secara lebih luas, lihat kawalan oksigen dalam kerja mikroskopi dan kultur.

Rajah untuk diletakkan di sebelah balang

Rajah di bawah merangkum artikel ini sebagai satu rujukan di meja makmal. Tiga keadaan jalur yang sama, dua arah tindak balas dan batas antara bukti penunjuk dengan pengesahan sistem.

Punca kegagalan yang mengekalkan warna biru atau memberikan keyakinan palsu

Kebanyakan kegagalan terbahagi kepada lima kumpulan. Setiap kumpulan mempunyai tanda tersendiri.

Balang atau kantung yang bocor terus membekalkan oksigen ke zon tindak balas. Jalur kekal biru atau kembali biru selepas memudar. Periksa penutup, gasket, pengapit dan permukaan kedapan sebelum menyalahkan kimianya.

Penjana gas yang telah habis atau tidak diaktifkan dengan betul tidak menyingkirkan oksigen. Dalam sistem lama yang diaktifkan dengan air, ketiadaan pemeluwapan sekitar 10 hingga 15 minit dan penutup yang tidak menjadi hangat sekitar 20 hingga 40 minit merupakan amaran awal bagi sistem tersebut. Paket yang terlalu kecil dalam balang yang terlebih muatan gagal dengan cara yang sama.

Pemangkin yang teracuni hanya berkaitan dengan sistem lama berasaskan hidrogen dan paladium, yang menggunakan paladium untuk menggabungkan hidrogen dan oksigen menjadi air. Kelembapan dan hidrogen sulfida merosakkannya. Banyak paket semasa tidak menggunakan paladium langsung, jadi jangan gunakan langkah pembetulan ini pada sistem yang tidak berkaitan.

Jalur yang terdegradasi atau salah dikendalikan boleh gagal tanpa tanda yang jelas. Pewarna dan bahan penurun kehilangan sifat boleh balik semasa penyimpanan, yang menjadi salah satu sebab formulasi hibrid dibangunkan untuk menahan pemudaran akibat cahaya dan kemerosotan semasa penyimpanan. Tolak stok yang tamat tempoh, stok dengan warna awal yang luar biasa, serta jalur yang dibasahkan apabila sepatutnya kering atau dibiarkan kering apabila perlu dibasahkan.

Kecerunan atau kelewatan tindak balas mengelirukan pembaca, bukannya menjejaskan kimia. Ruang udara yang tidak bercampur dengan baik, tiub tertutup rapat yang mengandungi oksigen terlarut dan medium separa pepejal masing-masing mengekalkan keadaan tersendiri lebih lama daripada yang ditunjukkan oleh jalur. Jalur resazurin berubah melalui warna merah jambu sebelum menjadi tidak berwarna dan sering dipasarkan sebagai lebih pantas, tetapi nilai ambangnya bergantung pada formulasi tersendiri dan tidak boleh digunakan untuk metilena biru.

Kawalan dan protokol bacaan yang wajar ditiru

Dua kawalan berkos rendah dapat mengesan kebanyakan kesilapan tafsiran. Letakkan jalur kawalan udara yang baharu dalam udara bilik sepanjang ujian. Jalur metilena biru yang berfungsi kekal biru di situ. Sesetengah penunjuk berbungkus pada mulanya pucat dan menjadi biru apabila dibuka, yang dengan sendirinya merupakan semakan fungsi. Selain itu, letakkan jalur baharu secara berkala dalam persediaan anaerob yang telah disahkan sebelum ini. Jalur itu sepatutnya mencapai titik akhir terturun yang disahkan dalam masa yang ditetapkan oleh produk. Jika mana-mana kawalan tidak bertindak seperti yang dijangka, gantikan kelompok produk itu sebelum mempercayai bacaan balang.

Protokol bacaan berpandukan mekanisme tersebut. Letakkan jalur di ruang udara pada kedudukan yang boleh dilihat tanpa membuka balang, dengan mengikuti helaian produk tentang sentuhan dengan dinding dan pembasahan. Rekodkan warna awal, masa balang ditutup rapat dan warna pada titik semakan yang ditetapkan oleh produk. Jika reka bentuk bekas membenarkannya, rekodkan bahawa penunjuk kekal terturun pada titik semakan yang ditetapkan semasa inkubasi. Rekodkan warna akhir sejurus sebelum pembukaan. Warna sebelum pembukaan itu ialah titik akhir bagi ujian tersebut. Selepas pembukaan, jangkakan jalur kembali biru dan jangan biarkan perubahan itu mengubah rekod sebelumnya.

Jika jalur kekal biru selepas masa yang ditetapkan, anggap keadaan anaerob belum disahkan. Periksa mengikut urutan: kedapan, paket, pemangkin jika ada, penghidratan penunjuk dan tarikh luput, kemudian fungsi penunjuk berbanding kawalan udara. Pertumbuhan atau ketiadaan pertumbuhan hanya patut ditafsirkan setelah atmosfera disahkan, menggunakan persediaan kultur anaerob dan kawalan organisma yang sesuai dengan aplikasi.

Jalur itu wajar dipercayai dalam ruang lingkupnya sendiri. Sama ada biru atau tidak berwarna, ia menjawab satu soalan tentang satu tempat pada satu masa. Ajukan soalan itu mengikut jadual, dengan kawalan di sebelahnya, dan ia memberikan jawapan yang boleh dipercayai. Jika anda menggunakannya untuk menilai kesterilan, setiap tiub atau keseluruhan tempoh inkubasi melalui satu pandangan sepintas lalu, tiada kimia penunjuk yang dapat membetulkan tafsiran tersebut.