Mengukur spesies oksigen reaktif dalam eksperimen metilena biru

Dua makmal menjalankan apa yang masing-masing namakan eksperimen antioksidan metilena biru. Satu melaporkan bahawa pewarna itu menekan spesies oksigen reaktif. Yang satu lagi melaporkan bahawa pewarna itu menghasilkannya. Kedua-duanya menunjukkan lengkung gerak balas dos yang jelas. Kedua-duanya jujur. Perbezaannya bukan disebabkan penipuan atau ketidakcekapan. Sebaliknya, kedua-dua kumpulan mengukur perkara berbeza di bawah cahaya berbeza, menggunakan prob yang menjawab soalan berbeza, kemudian menerangkan kedua-dua jawapan dengan istilah yang sama: ROS.

Metilena biru ialah molekul yang sukar diukur dengan tepat kerana ia mengambil bahagian dalam tindak balas kimia yang sepatutnya diperhatikannya. Dalam gelap, ia mengangkut elektron antara penderma dan penerima, lalu kembali ke bentuk asalnya, sedia untuk mengulangi kitaran. Di bawah cahaya, ia menjadi pemeka foto, mencapai keadaan triplet teruja yang membolehkannya memindahkan tenaga kepada oksigen untuk menghasilkan oksigen singlet atau memindahkan elektron untuk menghasilkan radikal dan hidrogen peroksida. Mana-mana prob yang dimasukkan ke dalam sistem itu boleh dioksidakan, diturunkan, dilunturkan atau disamarkan secara optik oleh pewarna itu sendiri. Oleh itu, soalan pertama bagi sebarang bacaan ROS bukanlah berapa nilainya. Sebaliknya, soalan itu ialah apa yang sebenarnya dikesan oleh asai tersebut, dan bagaimana pewarna mempengaruhi asai itu.

Amplex Red: asai hidrogen peroksida yang ditentukur

Gabungan metilena biru dan Amplex Red ialah padanan yang paling kukuh asasnya dalam literatur ini, apabila disediakan dengan betul. Tindak balas kimianya khusus: peroksidase lobak pedas menggunakan hidrogen peroksida untuk mengoksidakan substrat Amplex menjadi produk berpendarfluor, resorufin, dengan stoikiometri kira-kira satu kepada satu. Peroksida daripada sampel menghasilkan pendarfluor pada pengesan. Tiada spesies lain dalam kumpulan ROS yang lazim memacu tindak balas itu secara langsung.

Kelebihan utamanya ialah penentukuran. Penyelidik yang teliti menguji piawai peroksida yang diketahui dalam penimbal yang sama, dengan kepekatan peroksidase dan substrat yang sama, masa inkubasi yang sama serta tetapan optik yang sama, kemudian membandingkan bacaan sampel dengan lengkung itu. Dalam kajian mitokondria otak terasing yang menjadi asas kaedah ini, penulis melakukan tepat seperti itu, menambahkan kuantiti peroksida yang diketahui pada akhir setiap ujian, dan melaporkan angka sebagai kadar dalam pikomol seminit bagi setiap miligram protein, bukannya unit pendarfluor arbitrari. Itulah yang menukarkan cahaya pendar kepada suatu pengukuran.

Tiga butiran daripada kajian itu wajar dicontohi. Pertama, penulis mengesahkan isyarat menggunakan katalase, yang menguraikan peroksida. Peningkatan pendarfluor yang dicetuskan oleh metilena biru berhenti apabila katalase ditambahkan, mengesahkan bahawa isyarat itu berpunca daripada peroksida dan bukan artifak optik. Kedua, mereka menguji pencahayaan secara langsung dengan menggunakan pengatup pada alur pengujaan supaya sampel menerima satu perlapan daripada dos cahaya biasa, dan isyarat berkurang hanya sembilan peratus. Lebih daripada sembilan puluh peratus peroksida yang dilaporkan tidak bergantung pada cahaya pengukuran. Ketiga, mereka mengukur penyingkiran peroksida secara berasingan menggunakan elektrod dan mendapati bahawa pewarna itu meningkatkan penghasilan serta memperlahankan penyingkiran. Prob yang hanya melaporkan pendarfluor bersih akan mencampuradukkan kedua-dua kesan tersebut.

Asai ini masih mempunyai beberapa keadaan yang boleh menyebabkan kegagalan, dan metilena biru mencetuskan beberapa daripadanya. Pewarna itu menyerap secara meluas dalam kawasan merah yang sama dengan pancaran resorufin, maka pada kepekatan pewarna yang tinggi, sampel boleh menyamarkan isyaratnya sendiri melalui kesan penapis dalaman. Oleh itu, piawai hendaklah mengandungi kepekatan pewarna yang sama dengan sampel. Amplex Red juga boleh mengalami pengoksidaan foto dengan sendirinya, dan produknya, resorufin, boleh memasuki kitaran fotoredoks yang menghasilkan superoksida dan peroksida. Hal ini amat penting apabila eksperimen turut menyinari pemeka foto. Penyelesaian praktikalnya ialah menyinari sampel metilena biru terlebih dahulu, kemudian menguji alikuot dengan reagen Amplex dalam gelap, bukannya menyinari pewarna dan prob serentak. Akhir sekali, superoksida dismutase bukan sekadar menekan isyarat Amplex: penukaran superoksida kepada peroksida boleh meningkatkannya. Kawalan SOD yang meningkatkan pendarfluor bukanlah gagal. Ia telah mengenal pasti superoksida sebagai spesies huluan.

DCFDA: penunjuk pengoksidaan tidak spesifik

Padanan metilena biru dan DCFDA ialah punca kebanyakan kekeliruan. DCFH-DA ialah prekursor untuk pemuatan ke dalam sel. Esterase di dalam sel menanggalkan kumpulan asetatnya, meninggalkan DCFH yang tidak berpendarfluor, dan pengoksidaan DCFH menghasilkan DCF yang berpendarfluor. Senarai bahan yang mengoksidakannya panjang: radikal hidroksil, peroksidase dan perantara hem, nitrogen dioksida, asid hipoklorus serta radikal terbitan peroksinitrit. Hidrogen peroksida sahaja tidak mengoksidakannya secara langsung pada kadar yang berguna; pendarfluor yang bergantung pada peroksida biasanya memerlukan besi, protein hem atau tindak balas peroksidase dalam proses tersebut.

Kritikan yang patut dipetik oleh setiap bahagian kaedah datang daripada analisis DCFH sebagai prob oleh Kalyanaraman dan rakan-rakan, sebagaimana diringkaskan dalam kajian mitokondria otak yang menolak DCFDA atas sebab ini. Analisis itu menunjukkan bahawa pewarna tersebut bertindak balas dengan perlahan, dengan stoikiometri yang belum dicirikan, tanpa penentukuran yang sah, dan dengan sebatian bukan ROS. Prob itu juga menguatkan perkara yang diukurnya: pengoksidaan satu elektron pada DCFH menghasilkan radikal DCF yang bertindak balas dengan oksigen untuk membentuk superoksida, yang mengalami dismutasi menjadi peroksida tambahan. Bacaan itu sebahagiannya menghasilkan sendiri tindak balas kimia yang dilaporkannya.

Semua ini tidak menjadikan DCFDA tidak berguna. Sebaliknya, ia menjadikan DCFDA alat saringan, bukan alat pengenalpastian. Peningkatan pendarfluor DCF bermakna pengoksidaan prob yang bergantung pada oksidan telah meningkat. Ia tidak bermakna peroksida meningkat, dan pastinya tidak bermakna jumlah ROS meningkat, suatu kuantiti yang tidak diukur oleh mana-mana prob tunggal. Kajian metilena biru terdahulu yang bergantung pada pengoksidaan DCF pada kepekatan melebihi satu mikromolar melaporkan kesan prooksidan, manakala sistem lain pada zaman yang sama melaporkan perlindungan terhadap kematian sel yang dicetuskan oleh peroksida. Kedua-dua pemerhatian boleh benar bagi pewarna yang sama dalam konteks redoks yang berbeza, dan hasil DCF sahaja tidak dapat menentukan oksidan mana yang membawa isyarat tersebut. Kepentingan kajian mitokondria otak terdahulu ialah kajian itu menggantikan saringan ini dengan pengukuran peroksida yang ditentukur dan mengesan beban peroksida secara langsung: walaupun pada kepekatan seratus nanomolar, pewarna meningkatkan pelepasan peroksida beberapa kali ganda merentas setiap substrat dan keadaan respirasi yang diuji.

DCFDA mempunyai satu lagi perangkap khusus bagi metilena biru. Pewarna itu berwarna pekat dan aktif secara redoks, maka ia boleh melunturkan pendarfluor, memadamkan pancaran atau mengoksidakan sistem kimia prob secara bebas daripada ROS selular. Kawalan bebas sel yang mengandungi pewarna bersama prob tanpa sebarang sel bukan sekadar tambahan pilihan. Eksperimen itulah yang memberitahu anda sama ada pewarna berinteraksi dengan prob.

Pemerangkapan spin dan pengambilan oksigen: identiti dan fluks

Apabila prob berpendarfluor melaporkan bahawa sesuatu yang boleh dioksidakan telah muncul, resonans spin elektron dengan perangkap spin memberikan maklumat yang lebih hampir kepada identiti bahan itu. Kajian klasik fotokimia metilena biru menggunakan ESR untuk mengesan radikal askorbat daripada pewarna, askorbat dan cahaya, kemudian menunjukkan pembentukan peroksida dalam eksperimen pengambilan oksigen dan pembentukan radikal hidroksil bermangkinkan besi dalam ujian pemerangkapan spin. Setiap teknik menjawab soalan yang tidak dapat dijawab oleh teknik lain: ESR memberikan identiti radikal, pengambilan oksigen memberikan fluks tindak balas yang tidak bergantung pada sebarang prob berpendarfluor, dan gabungannya menunjukkan bahawa laluan oksigen singlet dan radikal beroperasi dalam sistem tersinari yang sama.

Hasil pada 1984 itu masih terasa seperti label amaran. Dengan adanya pencahayaan dan agen penurun, pewarna menghasilkan peroksida, dan apabila besi hadir, sistem menghasilkan radikal hidroksil, spesies paling reaktif dalam kumpulan tersebut. Penulis mengaitkan hal ini dengan askorbat dalam mata dan mempersoalkan penggunaan oftalmik tanpa pertimbangan teliti. Pembaca masa kini harus memperhatikan syaratnya: cahaya bersama agen penurun bersama besi. Singkirkan mana-mana satu daripadanya dan laluan itu menjadi lemah atau hilang.

Elektrod oksigen mempunyai kepentingan tersendiri atas sebab yang berbeza. Elektrod jenis Clark mengukur penggunaan oksigen bersih, yang mengesahkan bahawa tindak balas redoks yang dipacu oleh pewarna menggunakan oksigen molekul dan memberikan kinetik yang tidak boleh dipalsukan oleh artifak pendarfluor. Ia tidak mengenal pasti produk. Pembentukan peroksida, superoksida dan air, serta pereputan oksigen singlet, semuanya menggunakan oksigen. Fluks tanpa identiti sama tidak lengkapnya dengan identiti tanpa fluks. Sebab itulah makalah yang kukuh memadankan elektrod dengan asai peroksida yang ditentukur atau perangkap.

Mengapa hasil antioksidan bercanggah

Apabila ketiga-tiga bacaan dibandingkan bersebelahan, percanggahan yang kelihatan dalam literatur metilena biru dapat dijelaskan melalui perbezaan kaedah serta tiga fakta biologi.

Pertama, pewarna itu merupakan pengangkut elektron dan juga sumber peroksida. Dengan mengalihkan elektron daripada tapak respirasi tempat oksigen lazimnya menjadi superoksida, ia boleh mengurangkan satu ROS, sementara bentuk terturunnya menurunkan oksigen secara langsung menjadi peroksida, lalu meningkatkan ROS yang lain. Oleh itu, makmal yang berhadapan dengan kimia redoks mitokondria dan peranannya sebagai laluan pintasan patut menjangkakan jawapan yang bergantung pada prob: bacaan yang peka terhadap superoksida menurun, manakala bacaan peroksida meningkat dalam kuvet yang sama.

Kedua, peroksida pada dos rendah ialah isyarat, bukan sekadar kerosakan. Kajian mitokondria otak mencit yang menyusuli kajian terdahulu mendapati penghasilan peroksida daripada pewarna pada kepekatan serendah lima puluh nanomolar tanpa lesi DNA mitokondria pada aras terapeutik, dengan perlindungan terhadap lesi yang dicetuskan oleh rotenon selepas prarawatan. Hanya pada seratus mikromolar, jauh melebihi julat terapeutik, pewarna itu merosakkan fragmen DNA terpilih, manakala cahaya merah bersama pewarna pada dua puluh mikromolar menghasilkan oksigen singlet yang merosakkan semua fragmen yang diuji. Mekanisme yang dicadangkan bersifat hormetik: penghasilan peroksida yang ringan mencetuskan pertahanan antioksidan berkaitan Nrf2 dan biogenesis mitokondria, maka bacaan prooksidan jangka pendek mendahului hasil antioksidan jangka lebih panjang. Asai yang dibaca selepas satu jam dan asai yang dibaca selepas satu hari boleh memberikan hasil berbeza kerana keadaan biologi telah berubah antara kedua-duanya.

Ketiga, cahaya menentukan molekul mana yang hadir. Pencahayaan menyebabkan pewarna mengalami penyahmetilan ke arah pembentukan Azure B dan produk berkaitan, dan lampu mikroskop di atas piring sudah memadai untuk menjadikannya pemeka foto. Eksperimen dalam gelap dan eksperimen dengan pencahayaan ialah eksperimen yang berbeza, dan bahagian kawalan pencahayaan dan pengendalian pewarna dalam mana-mana protokol hendaklah memperlakukannya sedemikian.

Set kawalan minimum, dan cara menafsirkan sebarang dakwaan

Perbandingan di bawah ialah bahan rujukan asal bagi artikel ini. Sebelum menerima sebarang hasil ROS metilena biru, semak baris mana yang dilengkapkan oleh penulis dan baris mana yang dilangkau.

Daripada ini, terbit satu panduan tafsiran yang praktikal. Amplex dengan peroksidase, ditentukur dan disemak menggunakan katalase, memberikan bukti tentang peroksida. DCFDA memberikan bukti tentang pengoksidaan prob yang tidak spesifik, dan tidak lebih daripada itu. Pemerangkapan spin dengan kawalan penyingkir radikal memberikan bukti tentang identiti radikal. Pengambilan oksigen memberikan bukti tentang fluks. Ayat yang mendakwa lebih daripada apa yang dapat disokong oleh asainya, walau seyakin mana pun penulisannya, ialah ayat tentang prob, bukan tentang pewarna. Perbincangan berkaitan tentang kebergantungan pada dos dan julat hormetik, aliran elektron mitokondria, gangguan asai dalam sampel berwarna, serta artifak pencahayaan mikroskopi memperluas setiap perkara ini, dan setiap satunya kekal sah setelah rujukan pemegang tempatnya digantikan.