Biru metilena dan nitrik oksida: NOS, cGMP, dan pengisyaratan vaskular

Soalannya kedengaran mudah: adakah biru metilena merencat nitrik oksida? Di makmal, jawapannya terbahagi kepada empat soalan berasingan, dan setiap satunya memerlukan ujian eksperimen yang berbeza. Kekeliruan antara soalan-soalan ini ialah sebab utama penulisan tentang biru metilena dan nitrik oksida kedengaran yakin tetapi kabur.

Bayangkan isyarat nitrik oksida sebagai rantai dengan empat mata rantai. Gen ditranskripsikan untuk menghasilkan nitrik oksida sintase. Enzim itu menukarkan arginina kepada nitrik oksida. Gas tersebut meresap ke sasarannya sebelum bertindak balas dengan sesuatu yang lain. Guanilat siklase larut mengesannya dan menghasilkan GMP siklik. Kesan biru metilena pada setiap mata rantai telah diterbitkan, tetapi buktinya datang daripada sediaan, kepekatan, dan isoform yang berbeza. Keputusan pada satu mata rantai tidak membuktikan tindakan pada mata rantai yang lain.

Rantaian kanonik, diterangkan secara ringkas

Dalam dinding salur darah, urutan lazimnya adalah seperti berikut. Rangsangan bertindak pada sel endotelium. Nitrik oksida sintase endotelium, yang dipanggil eNOS atau NOS3, menghasilkan denyutan kecil nitrik oksida. Gas itu meresap ke dalam sel otot licin bersebelahan, mengikat heme besi dalam keadaan terturun pada guanilat siklase larut, dan mempercepat penukaran GTP kepada GMP siklik. GMP siklik mengaktifkan protein kinase G, pengendalian kalsium berubah, dan otot mengendur.

Terdapat rantaian kedua yang wajar dibezakan. Semasa jangkitan atau pendedahan kepada sitokin, sel mentranskripsikan enzim yang berbeza, iaitu nitrik oksida sintase teraruh atau iNOS, juga dipanggil NOS2. Enzim ini menghasilkan fluks nitrik oksida yang lebih besar dan lebih berpanjangan berbanding eNOS. Isoform ketiga, NOS neuron atau nNOS, berada dalam konteks yang lain pula. Apabila sesuatu makalah menyebut nitrik oksida sintase tanpa menyatakan isoformnya, berhenti dan semak isoform yang diukur. Gambaran keseluruhan tentang cara biru metilena memindahkan elektron menekankan perkara yang sama bagi sasaran redoks secara umum: perantara pemindahan itu tidak bertindak dengan sendirinya, dan pasangan pada setiap hujung menentukan hasilnya.

GMP siklik yang diukur juga merupakan bacaan bersepadu, bukan asai enzim secara langsung. Parasnya mencerminkan sintesis oleh siklase ditolak penguraian oleh fosfodiesterase, khususnya PDE5 dalam otot licin vaskular. Oleh itu, penurunan GMP siklik bermakna kurang isyarat sampai kepada pengesan. Penurunan itu sahaja tidak mengenal pasti mata rantai yang gagal.

Mata rantai 1: kurang enzim iNOS dihasilkan

Dalam makrofaj mencit yang dirangsang dengan lipopolisakarida bakteria, interferon gama, atau kedua-duanya, biru metilena menghalang peningkatan protein iNOS yang dijangkakan dan menekan RNA pengutus iNOS dengan kuat dalam eksperimen transkripsi makrofaj. Bahagian yang memberikan maklumat penting ialah perkara yang tidak berubah. Penguraian perencat I kappa B alfa, pemfosforilan NF kappa B dan STAT1, serta pergerakan faktor-faktor tersebut ke dalam nukleus sebahagian besarnya kekal tidak terjejas. Yang berkurang ialah pengikatannya pada DNA, disahkan melalui imunopresipitasi kromatin yang menunjukkan pengurangan penghunian pada promoter iNOS.

Itu ialah kesan pengawalseliaan gen di hulu yang menentukan jumlah enzim, bukan sekatan akut terhadap enzim yang sedia ada. Kesan ini tergolong dalam pengisyaratan keradangan, apabila faktor transkripsi mesti mengikat promoter sebelum protein terbentuk. Kesan ini tidak memberikan maklumat langsung tentang eNOS konstitutif dalam salur darah pada keadaan rehat, dan perlu diterangkan dalam konteks tersebut.

Mata rantai 2: enzim NOS yang sedia ada bertindak lebih perlahan

Satu kajian pada tikus menguji peringkat yang berbeza. Tikus jantan dalam keadaan sedar menerima lipopolisakarida secara intravena, kemudian tiga jam selepas itu menerima sama ada larutan salin atau biru metilena pada 3 mg per kg secara intravena. Aktiviti nitrik oksida sintase dalam hipotalamus basal medial diukur melalui penukaran arginina berlabel kepada sitrulina dalam kajian aktiviti NOS hipotalamus. Tekanan bersama larutan salin sahaja mengaruh sedikit aktiviti tidak bergantung pada kalsium, dan lipopolisakarida meningkatkannya kepada kira-kira sepuluh kali paras kawalan. Biru metilena menghapuskan kedua-dua komponen teraruh itu. Aktiviti konstitutif yang bergantung pada kalsium tidak berubah dalam tisu tersebut pada dos dan titik masa itu.

Tafsirkan keputusan itu tepat sebagaimana dinyatakan: aktiviti jenis iNOS yang diukur ditekan dalam keadaan tersebut. Ia bukan ukuran ekspresi gen, dan bukan bukti bahawa biru metilena sentiasa memilih iNOS berbanding eNOS atau nNOS. Kajian enzim ditulenkan mengukuhkan keperluan untuk berhati-hati ini. Dalam asai langsung nitrik oksida sintase ditulenkan, biru metilena menyekat sepenuhnya pembentukan sitrulina pada 30 micromolar, dengan kepekatan perencatan separuh hampir 5.3 micromolar tanpa superoksida dismutase dan 9.2 micromolar dengan enzim itu, seperti dilaporkan dalam perbandingan NOS ditulenkan dan guanilat siklase. Satu kajian nNOS ditulenkan yang berasingan menunjukkan penglibatan pengoksidaan heme yang terikat pada enzim. Pengajaran praktikalnya ialah perencatan NOS secara langsung memang berlaku dalam sistem terasing, tetapi keputusan hipotalamus itu tidak boleh diperluas menjadi dakwaan umum bahawa biru metilena tidak menjejaskan semua NOS konstitutif di mana-mana.

Mata rantai 3: nitrik oksida hilang sebelum sampai

Demonstrasi paling jelas bahawa sesuatu selain sekatan enzim boleh menjelaskan penurunan GMP siklik datang daripada sel otot licin arteri pulmonari arnab yang dikultur. Reka bentuk eksperimen itu memintas sepenuhnya NOS endogen dengan menambahkan penderma nitrik oksida secara langsung, kemudian menguji sama ada biru metilena masih menekan respons GMP siklik dalam kajian superoksida otot licin vaskular.

Tiga penderma diuji dari 1 hingga 100 micromolar: S nitroso L sisteina, natrium nitroprusida, dan analog ternyahamina yang stabil, dipanggil MPANO. Kesemuanya meningkatkan GMP siklik antara kira-kira 1.5 kali ganda dan 12 kali ganda. Biru metilena pada 10 micromolar merencat dua penderma pertama sebanyak 51 hingga 100 peratus dan tidak mengubah respons MPANO. Jika biru metilena hanya menyekat tapak pemangkin siklase, selektiviti terhadap penderma itu sukar dijelaskan, kerana ketiga-tiganya bertumpu pada enzim hiliran yang sama.

Tiga kawalan kemudiannya mengaitkan mekanisme itu dengan superoksida. Pertama, penghasilan superoksida ekstrasel menggunakan xantina bersama xantina oksidase menghasilkan semula corak yang sama: CYSNO dan nitroprusida disekat, MPANO tidak terjejas. Kedua, biru metilena menyebabkan penghasilan superoksida daripada sel otot licin yang bergantung pada dos dan masa, diukur melalui penurunan sitokrom c. Ketiga, superoksida dismutase mencegah sepenuhnya perencatan itu manakala katalase tidak, yang menunjukkan superoksida, bukannya hidrogen peroksida, sebagai spesies penyebab terdekat dalam sediaan tersebut.

Versi kokultur eksperimen ini wajar dinyatakan kerana ia menentukan lokasi kesan tersebut. Sel endotelium pada kaca penutup dikokultur sebentar dengan sel otot licin, lalu faktor endotelium yang dilepaskan pada keadaan basal meningkatkan GMP siklik otot licin tiga hingga lapan kali ganda. Praperawatan salah satu kompartmen dengan biru metilena mengurangkan isyarat itu, dan superoksida dismutase memulihkan sebahagian kesan praperawatan endotelium. Dengan kata lain, biru metilena tidak semestinya perlu bertindak di dalam sel otot licin yang berfungsi sebagai pengesan. Ia boleh mengurangkan isyarat dengan menyingkirkan pengutus semasa dalam perjalanan. Panduan membaca penyelidikan biru metilena menganggap ini sebagai prinsip umum: nyatakan kompartmen tempat intervensi berlaku sebelum menamakan sasaran molekul.

Menyebutnya sebagai perencatan NOS adalah salah. Tiada langkah sintase diperlukan untuk penderma itu berfungsi, namun isyaratnya tetap menurun.

Mata rantai 4: pengesan itu sendiri kurang responsif

Kesan langsung pada guanilat siklase larut memang wujud, tetapi kepekatannya penting. Dalam perbandingan enzim ditulenkan yang dirujuk di atas, siklase yang dirangsang oleh nitrik oksida memerlukan kira-kira 60 micromolar biru metilena untuk perencatan separuh, berbanding perencatan separuh NOS hampir 5 hingga 9 micromolar, dan bahkan 1 millimolar hanya menghasilkan sekatan maksimum separa. Itu merupakan perbezaan kira-kira enam hingga sebelas kali ganda. Oleh itu, eksperimen sel pada kepekatan micromolar rendah yang menurunkan GMP siklik tidak boleh dilabel sebagai perencatan siklase selektif berdasarkan nilai GMP siklik semata-mata.

Satu kajian redoks yang lebih kemudian menambah peringatan kedua: biru metilena menyahaktifkan siklase yang diaktifkan oleh nitrik oksida melalui mekanisme yang berbeza daripada pengoksidaan mudah besi heme oleh udara. Jadi, pengesan itu boleh terjejas, tetapi kimianya belum dipastikan, dan jurang kepekatan tersebut bermakna kesan superoksida dan NOS wajar diketepikan terlebih dahulu pada pendedahan micromolar rendah. Di sinilah juga kawalan fosfodiesterase perlu diambil kira. Melainkan penguraian diukur atau disekat, pengurangan pengumpulan GMP siklik selaras dengan sintesis yang berkurang, penguraian yang lebih cepat, atau kedua-duanya.

Mengapa ini tidak boleh diringkaskan menjadi satu dakwaan tentang tekanan darah

Setiap mata rantai dibuktikan dalam sistem yang berbeza. Transkripsi makrofaj bukan aktiviti enzim hipotalamus. Aktiviti hipotalamus selepas lipopolisakarida bukan tonus endotelium pada keadaan rehat. Faktor endotelium yang dilepaskan pada keadaan basal dalam kokultur bukan vasodilatasi yang dirangsang oleh agonis. Sel arteri pulmonari yang dikultur pada 10 micromolar biru metilena bukan peredaran darah manusia. Merangkum semuanya menjadi pernyataan seperti biru metilena meningkatkan tekanan darah dengan menyekat nitrik oksida mengetepikan perbezaan yang memang ingin dikekalkan melalui kawalan eksperimen tersebut.

Tiga semakan memastikan penerangan ini tepat. Pertama, nyatakan isoformnya: eNOS untuk tonus vaskular pada keadaan rehat, iNOS untuk fluks keradangan teraruh, nNOS untuk konteks neuron dan sesetengah enzim ditulenkan. Kedua, nyatakan cara isyarat nitrik oksida dibekalkan: sintesis endogen, pelepasan endotelium basal, atau penderma tertentu seperti CYSNO, nitroprusida, atau MPANO, kerana penderma stabil itu tahan terhadap biru metilena sedangkan penderma yang labil tidak. Ketiga, nyatakan kepekatan dan pemulihannya: pemulihan oleh superoksida dismutase menunjukkan penglibatan superoksida, kegagalan katalase tidak menyokong hidrogen peroksida sebagai penyebab dalam sediaan tersebut, peniruan oleh xantina oksidase menunjukkan bahawa mekanisme itu memadai, dan asai enzim ditulenkan membezakan kesan langsung pada pemangkinan daripada kehilangan semasa perjalanan.

Rumusan ringkasnya ialah ini. Biru metilena lebih sesuai dianggap sebagai pengganggu pada pelbagai tapak dalam pengisyaratan nitrik oksida kepada GMP siklik, bukannya sebagai penyekat siklase selektif. Bergantung pada sediaan dan kepekatan, ia boleh mengurangkan pengikatan faktor transkripsi iNOS, merencat enzim NOS secara langsung, mengurangkan ketersediaan nitrik oksida melalui penghasilan superoksida, dan menjejaskan siklase yang diaktifkan oleh nitrik oksida. Peranan pengisyaratan GMP siklik dalam kajian vaskular dan perbandingan penderma nitrik oksida yang digunakan dalam asai sel masing-masing membincangkan satu daripada cabang tersebut dengan lebih terperinci, manakala kaedah yang digunakan untuk memisahkan kesan redoks daripada kesan enzim menerangkan mengapa gabungan superoksida dismutase, katalase, dan kawalan penderma stabil begitu kerap muncul dalam literatur ini.

Nilai GMP siklik yang rendah selepas biru metilena menunjukkan rantaian yang terputus. Hanya kawalan eksperimen dapat menentukan mata rantai yang terputus.