Biru metilena baharu dan pewarnaan retikulosit: pewarna berbeza dan kaedah sel hidup

Seorang pelajar menyediakan pengiraan retikulosit, memesan biru metilena, mencampurkannya dengan darah, dan hampir tidak melihat apa-apa. Rakan sekelasnya menggunakan botol berlabel biru metilena baharu dan memperoleh filamen biru yang jelas di dalam sebahagian sel darah merah. Pelajar pertama menganggap botol kedua lebih segar atau lebih pekat. Kedua-dua anggapan itu salah. Botol itu mengandungi molekul yang berbeza.

Kesilapan konsep inilah yang mendasari kebanyakan kekeliruan dalam bidang ini. Namanya memberi gambaran bahawa biru metilena baharu ialah kelompok biru metilena yang ditambah baik. Namun, kimianya menunjukkan sebaliknya. Biru metilena baharu N ialah pewarna fenotiazina yang berbeza, dengan nombor Colour Index tersendiri, corak penggantian tersendiri, dan peranan piawai tersendiri dalam hematologi. Apabila perbezaan ini jelas, aspek lain kaedah tersebut (mengapa sel mesti hidup semasa diwarnakan, apa yang dikira sebagai retikulosit, kedudukan jasad Heinz, dan bila biru kresil cemerlang digunakan) menjadi mudah difahami.

Jawapan ringkas

Biru metilena baharu N, reagen hematologi, lazimnya dikenal pasti sebagai Basic Blue 24 dalam rekod PubChem bagi biru metilena baharu, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formula C18H22ClN3S. Biru metilena biasa ialah metiltioninium klorida, Basic Blue 9, dalam rekod PubChemnya, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formula C16H18ClN3S. Dari segi struktur, biru metilena baharu mempunyai dua kumpulan metil pada cincin serta rantai sisi etilamino, manakala biru metilena mempunyai kumpulan dimetilamino. Perbezaan itu mengubah sifat pewarnaan. Teks hematologi menerangkan biru metilena biasa sebagai pewarna retikulosit yang agak lemah dan biru metilena baharu sebagai pewarna yang menghasilkan warna lebih pekat dan sekata, perbandingan yang diringkaskan dalam topik ScienceDirect tentang biru metilena baharu.

Ya, biru metilena baharu ialah pewarna supravital. Pewarnaan supravital bermaksud pewarnaan sel hidup selepas dikeluarkan daripada tubuh dan sebelum fiksasi, seperti yang ditakrifkan dalam ulasan NCBI tentang prinsip pewarnaan supravital. Biru metilena baharu dan biru kresil cemerlang kedua-duanya tergolong dalam kategori ini, dan piawaian retikulosit CLSI secara khusus merangkumi biru metilena baharu sebagai pewarna supravital. Pelajar kadangkala menganggapnya sama seperti pewarnaan Romanowsky pada sediaan apusan yang telah difiksasi. Pemahaman itu tidak sesuai di sini. Jika fiksasi dilakukan dahulu, kaedah ini tidak lagi berfungsi.

Bagi pembaca yang meneliti nama pewarna yang hampir serupa, biru metil berbanding biru metilena membincangkan kekeliruan lain yang lebih besar antara pewarna triarilmetana anionik dengan keluarga fenotiazina kationik. Gambaran keseluruhan pewarnaan makmal meletakkan kerja supravital dalam konteks kaedah sediaan apusan terfiksasi, dan panduan morfologi sel darah menunjukkan kedudukan penilaian retikulosit dalam penilaian pembezaan sel yang lebih luas.

Satu perkara yang perlu diberi perhatian dalam katalog: terdapat bentuk garam ganda zink klorida yang berasingan bagi biru metilena baharu di bawah CAS 6586-05-6. Oleh itu, bahagian kaedah perlu menyatakan bentuk garam dan pembekal, bukan sekadar nama lazimnya.

Apa yang sebenarnya berlaku dalam pewarnaan supravital

Retikulosit ialah sel darah merah muda yang telah kehilangan nukleusnya tetapi masih mengandungi baki RNA ribosom. Dalam sediaan basah tanpa pewarnaan, RNA itu tidak kelihatan. Pewarna supravital memasuki sel hidup dan memendakkan atau menggumpalkan RNA itu menjadi granul dan filamen biru, iaitu bahan retikulofilamen yang dilihat di bawah rendaman minyak. Oleh itu, jaringan tersebut ialah hasil pewarnaan, bukannya rangka yang telah sedia terbentuk dan hanya menunggu untuk diwarnakan. Inilah sebabnya pemboleh ubah protokol (kepekatan pewarna, penimbal, nisbah darah kepada pewarna, suhu, masa) sama pentingnya dengan nama pewarna.

Implikasi praktikalnya ialah urutan kerja yang ketat: campurkan dahulu darah yang mengandungi antikoagulan dengan pewarna, inkubasikan, kemudian sediakan apusan dan periksa tanpa fiksasi serta tanpa pewarna balas. Fiksasi sebelum pewarnaan, atau pewarna balas yang mengaburkan filamen samar, memusnahkan maklumat yang diperlukan untuk pengiraan.

Protokol kerja retikulosit menggunakan biru metilena baharu

Tiada satu formulasi sejagat, jadi laporkan formulasi yang digunakan. Tiga varian yang didokumenkan menunjukkan julat kaedah yang ada.

Prosedur klasik jenis Brecher menggunakan kira-kira 0.5 peratus biru metilena baharu dengan kalium oksalat, dicampurkan dalam isipadu yang sama dengan darah EDTA yang telah dicampur sebati, dan diinkubasikan selama kira-kira 10 hingga 15 minit pada suhu bilik. Selepas dicampurkan semula dengan perlahan, apusan baji nipis disediakan, dikeringkan di udara, dan diperiksa tanpa fiksasi di bawah kanta objektif rendaman minyak 100x. Prosedur NCBI untuk pengiraan retikulosit menerangkan aliran kerja ini serta bingkai pengiraan yang digunakan bersamanya.

Varian Dacie dan Lewis menggunakan 1.0 peratus biru metilena baharu dalam larutan salin sitrat, dicampurkan dengan 2 hingga 4 isipadu darah dan dikekalkan pada 37 C selama 15 hingga 20 minit sebelum apusan dibuat. Pelaksanaan harmonisasi terkini bagi prosedur CLSI H44 menggunakan larutan yang lebih cair, iaitu 0.1 peratus dalam larutan salin berpenimbal fosfat pada pH 7.4, dengan inkubasi pada 20 C selama 10 minit dan tanpa fiksasi, seperti yang dilaporkan dalam kajian harmonisasi NMB 2026.

Peraturan pengiraan adalah sama bagi semua varian. Kira sel sebagai retikulosit apabila sel itu mengandungi sekurang-kurangnya dua granul berwarna biru atau segmen filamen yang berasingan, supaya endapan pewarna terpencil tidak termasuk dalam kiraan. Kira sekurang-kurangnya 1,000 sel darah merah dalam kerja rutin dan laporkan retikulosit sebagai peratusan. Pada peratusan rendah, keperluan statistik menuntut lebih banyak sel dikira. Ulasan metodologi CLSI H44 menyatakan bahawa pada paras retikulosit hampir 1 peratus, kira-kira 4,400 sel diperlukan untuk mengehadkan variasi pengiraan kepada 5 peratus, dalam ulasan CLSI H44 di De Gruyter. Cakera okular Miller memudahkan pengiraan sejumlah besar sel. Tapis pewarna atau sediakan pewarna segar, kerana mendakan menyerupai inklusi bergranul.

Jasad Heinz dalam sediaan yang sama

Apusan supravital yang sama juga boleh menunjukkan jasad Heinz, iaitu agregat hemoglobin yang teroksida dan ternyahasli, bukannya baki RNA. Dalam sediaan biru metilena baharu, jasad ini kelihatan bulat, sering hadir secara tunggal dan berhampiran membran, dengan warna biru yang lebih cerah daripada bahan retikulofilamen. Jasad ini tidak terpelihara dengan baik selepas fiksasi dan pewarnaan balas, jadi periksa apusan tanpa fiksasi. Protokol terkini yang menggunakan 20 mikroliter darah EDTA dengan 20 mikroliter biru metilena baharu 1 peratus dan inkubasi selama 15 minit mengukur bilangan sel positif jasad Heinz dalam kalangan 250 eritrosit, dalam kajian PMC yang melaporkan prosedur tersebut.

Dua perbezaan membantu mengelakkan salah tafsiran. Pertama, ungu metil dan ungu kristal mewarnakan jasad Heinz dengan lebih kuat berbanding biru metilena baharu, seperti yang dinyatakan dalam topik ScienceDirect tentang jasad Heinz. Biru metilena baharu ialah pilihan yang praktikal apabila retikulosit dan jasad Heinz dinilai bersama, bukannya pewarna khusus jasad Heinz yang paling kuat. Kedua, inklusi HbH dalam trait talasemia alfa menghasilkan banyak titik halus di seluruh sel selepas pewarnaan supravital, manakala jasad Heinz klasik lebih sedikit, lebih besar, dan sering berkaitan dengan membran. Endapan pewarna ialah unsur ketiga yang menyerupainya: endapan ini terletak di luar satah fokus sel dan berbeza antara medan pandangan.

Biru kresil cemerlang berbanding biru metilena baharu

Kedua-dua pewarna ialah pewarna supravital untuk retikulosit, tetapi usaha penyeragaman mengutamakan salah satu daripadanya. Kaedah retikulosit CLSI H44-A2, yang dibangunkan bersama Majlis Antarabangsa bagi Penyeragaman dalam Hematologi dan disenaraikan pada halaman piawaian CLSI H44, menetapkan pewarnaan darah EDTA dengan biru metilena baharu sebagai kaedah perbandingan manual. Pengajaran hematologi klasik turut sependapat tentang rupanya: biru metilena baharu menghasilkan pewarnaan filamen yang lebih pekat dan sekata, manakala biru kresil cemerlang menunjukkan lebih banyak variasi antara kelompok dan sampel.

Status itu perlu disertai penjelasan tentang batasannya. Garis panduan ICSH untuk penilaian penganalisis menerima mikroskopi manual menggunakan biru metilena baharu sebagai pendekatan perbandingan rujukan, tetapi menyifatkannya sebagai subjektif dan mempunyai kejituan yang agak rendah; prosedur rujukan sitometri aliran diutamakan jika tersedia. Perbandingan 100 spesimen pada 2022 mendapati bias berbanding penganalisis yang digunakan adalah lebih rendah dengan biru kresil cemerlang berbanding biru metilena baharu, seperti yang dilaporkan dalam perbandingan kaedah pewarnaan di PMC. Rumusan yang dapat dipertahankan untuk pelajar: gunakan biru metilena baharu sebagai pembanding manual piawai, sahkan mana-mana kaedah biru kresil cemerlang setempat dengan membandingkannya dengan kaedah itu atau kaedah automatik, dan jangkakan serakan keputusan yang lebih luas daripada mikroskopi manual tanpa mengira pewarna yang digunakan. Literatur penyeragaman terdahulu turut menyarankan Azure B yang ditulenkan sebagai alternatif yang lebih tulen secara kimia kerana kelompok pewarna komersial berbeza-beza, dalam kajian Marshall tentang Azure B, yang menjelaskan mengapa gred reagen masih dibincangkan dalam perbincangan kaedah.

Mengelakkan kesilapan lazim

Empat kesilapan menyebabkan kebanyakan sediaan gagal. Memesan biru metilena biasa dan bukannya biru metilena baharu N menghasilkan pewarnaan yang lemah kerana faktor kimia, bukan teknik. Melakukan fiksasi atau pewarnaan balas sebelum pemeriksaan menghilangkan isyarat supravital. Mengira mendakan pewarna sebagai granul meningkatkan hasil kiraan secara palsu; peraturan dua granul dan pewarna yang ditapis dapat mencegahnya. Mengira terlalu sedikit sel apabila peratusan retikulosit rendah menghasilkan angka yang kelihatan jitu tetapi mempunyai had keyakinan yang luas. Setiap kesilapan mempunyai ciri yang sama: pemeriksa mikroskop menyalahkan mikroskop atas hasil yang sebenarnya telah ditentukan pada langkah penggunaan reagen.