लेख
मेथिलीन ब्लू पेशींमध्ये कसे प्रवेश करते: अपचयन, पुनःऑक्सिडीकरण आणि पटलातील विभाजन
एका पात्रातील अंतःस्तरीय पेशी मेथिलीन ब्लू ग्रहण करताना पाहिल्यास सर्वांत सहज सुचणारा निष्कर्षच चुकीचा ठरतो. माध्यमाचा निळा रंग कमी होतो, पेशींमध्ये निळे कण दिसू लागतात, म्हणून रंगद्रव्याने निळ्या रेणूच्या रूपातच पटल ओलांडले असणार, असे वाटते. प्रयोग मात्र वेगळेच सांगतात. निळे रूप पटल क्वचितच ओलांडते. पटल ओलांडते ते रंगहीन रूप; आत दिसणारा निळा रंग प्रवेशानंतर आतच तयार होतो.
हा उलटा क्रम महत्त्वाचा आहे, कारण रंगांकनातून काय समजू शकते आणि काय समजू शकत नाही, हे त्यावर ठरते. निळे कण म्हणजे पुनःऑक्सिडीकरण होऊन पेशीअंगकांमध्ये अडकलेले ऑक्सिडीकृत रंगद्रव्य. ते पेशीतील एकूण रंगद्रव्याचे प्रमाण दर्शवत नाहीत, अपचयित रंगद्रव्याचा साठा दर्शवत नाहीत आणि जैविक परिणामही मोजत नाहीत. हे का घडते, ते समजण्यासाठी तीन पायऱ्या पाहा: पृष्ठभागावरील अपचयन, अपचयित रूपाचे विसरण, आणि आत होणारे पुनःऑक्सिडीकरण व अडकणे.
दोन्ही रूपे वेगवेगळ्या रेणूंप्रमाणे वागतात
ऑक्सिडीकृत मेथिलीन ब्लू ही सपाट, धनभारित वलयांची रचना आहे. ते पाण्यात विरघळते, सुमारे 600 ते 700 nanometers या पट्ट्यात प्रकाश जोरदारपणे शोषते आणि निळे दिसते. विद्युतभार हाच इथे महत्त्वाचा मुद्दा आहे. विद्युतभारित, जलस्नेही रेणू लिपिड पटलातून सहज जात नाही; म्हणून संशोधन साहित्यात काळजीपूर्वक वापरलेला शब्दप्रयोग म्हणजे पटलातून तुलनेने न जाणारे, पूर्णपणे न जाणारे नव्हे.
अपचयित मेथिलीन ब्लूला ल्युकोमेथिलीन ब्लू म्हणतात. ते रंगहीन, विद्युतभाररहित आणि चरबीत विरघळणारे असते. विद्युतभार काढून टाकल्यावर पटल अडथळा राहत नाही. अपचयित रेणू सहज विसरणाने पटल ओलांडतो, आणि आत अधिक ऑक्सिडीकारक कप्प्यात पोहोचल्यावर तो पुन्हा इलेक्ट्रॉन गमावून निळ्या, विद्युतभारित आणि अडकलेल्या रूपात परतू शकतो. त्यामुळे रंगद्रव्याचे रेडॉक्स रसायनशास्त्र हीच त्याच्या वाहतुकीची यंत्रणाही आहे. इलेक्ट्रॉनची संख्या बदलली की पारगम्यताही बदलते.
पहिल्या पायरीसाठी लागणारे इलेक्ट्रॉन पेशीतूनच मिळतात. सस्तन प्राण्यांच्या पेशी प्लाझ्मा पटलाच्या आरपार इलेक्ट्रॉन वाहतूक करतात; अपचयकारी समतुल्ये पेशीतील दात्यांकडून पृष्ठभागावरील स्वीकारकांकडे नेली जातात. प्लाझ्मा पटलाच्या आरपार चालणारी ही क्रिया पेशीचे सामान्य कार्य आहे आणि बहुतेक पेशीप्रकारांत आढळते. थायाझीन रंगद्रव्यांवर काम करणारे अंतःस्तरीय पृष्ठभागावरील रिडक्टेज इतर अशा एन्झाइमांप्रमाणेच एका महत्त्वाच्या बाबतीत वागते: पुढील पायऱ्या थांबवणाऱ्या मात्रांमध्ये सायनाइड आणि अझाइड उपस्थित असतानाही ते कार्यरत राहते. या टप्प्यांतील फरकावरच संपूर्ण स्पष्टीकरण आधारलेले आहे.
आधी विभाजनाचा विचार आला, आणि त्यातून ग्रहण जवळजवळ स्पष्ट झाले
1929 मध्ये रॉकफेलर इन्स्टिट्यूटमधील मेरियन इर्विन यांनी अधिक सोपा प्रश्न विचारला. कदाचित रंगद्रव्याचा प्रवेश म्हणजे केवळ पाणी आणि पेशीतील चरबीयुक्त थर यांच्यातील विभाजन असेल, आणि प्रयोगशाळेत क्लोरोफॉर्मचा थर त्या चरबीयुक्त थरांचे प्रतिनिधित्व करू शकेल. त्यांच्या वर्णपटप्रकाशमितीय प्रवेश अभ्यासांमध्ये रंगद्रव्याची जलीय द्रावणे क्लोरोफॉर्मसोबत हलवली गेली आणि सेंद्रिय प्रावस्थेत जाणारे रंगद्रव्य व जिवंत शैवाल पेशींमध्ये प्रवेश करणारे रंगद्रव्य यांची तुलना केली गेली.
त्या कामातील दोन निष्कर्ष आजही लक्ष देण्याजोगे आहेत. पहिला म्हणजे, व्यावसायिक मेथिलीन ब्लू द्रावणांमध्ये ट्रायमिथाइल थायोनिन होते, ज्याला आता azure B म्हणतात. ही अशुद्धी मेथिलीन ब्लूपेक्षा वेगाने प्रवेश करत होती, विशेषतः क्षारीय pH वर, जिथे लिपिडमध्ये विरघळणारे मुक्त क्षारक रूप प्राबल्यात असते. मेथिलीन ब्लूचा प्रवेश वाटणाऱ्या काही निरीक्षणांमध्ये प्रत्यक्षात azure B चाच निवडक प्रवेश होत होता. दुसरा म्हणजे, आयनीकरणाची अवस्था ठरवून pH परिणाम ठरवत होता, आणि अखंड पेशींपेक्षा इजा झालेल्या पेशींमध्ये खूप अधिक रंगद्रव्य प्रवेश करत होते. कृत्रिम प्रणाली आणि जिवंत पेशी प्रत्येकी काय शोषून घेतात, हे विभाजन गुणांक आणि विद्युतभाराची अवस्था ठरवत होती. दोन्हींत दिसणाऱ्या साम्यामुळे पेशीच्या सीमेवर अजलीय थर असण्याच्या कल्पनेला आधार मिळाला.
या प्रतिमानाने लिपिड आणि आयनीकरणाचे महत्त्व दूरदृष्टीने ओळखले होते. पण स्वतःच्याच रूपात विभाजित होणारे रंगद्रव्य आणि पृष्ठभागावर रासायनिक रूपांतर होऊन दुसऱ्या रूपात पटल ओलांडणारे व आत पुन्हा मूळ रूपात बदलणारे रंगद्रव्य यांतील फरक त्यातून ओळखता येत नव्हता. हा फरक समजण्यासाठी वेगळा प्रयोग आवश्यक होता, आणि तो सत्तर वर्षांनी फुफ्फुसांच्या अंतःस्तरातील पेशींमध्ये झाला.
बाहेर अपचयन, आत अडकणे
मर्कर आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांनी संवर्धित गोवंशीय फुफ्फुसीय धमनीच्या अंतःस्तरीय पेशींवर काम केले आणि तीन पायऱ्यांचा क्रम सुचवला: ऑक्सिडीकृत रंगद्रव्याचे पेशीच्या पृष्ठभागावर अपचयन होऊन ते रंगहीन, लिपिडस्नेही रूपात बदलते; अपचयित रूप विसरणाने आत जाते; आणि पेशींतर्गत पुनःऑक्सिडीकरणातून पटलातून न जाणारे ऑक्सिडीकृत रूप पुन्हा तयार होते व साचते. त्यांच्या अंतःस्तरीय पेशींतील थायाझीन ग्रहणाच्या अभ्यासात या क्रमातील ठरावीक टप्पे रोखण्याचा प्रयत्न करून त्याची चाचणी घेतली गेली.
पहिले साधन होते फेरिसायनाइड, पेशीत प्रवेश करू न शकणारा इलेक्ट्रॉन स्वीकारक. पृष्ठभागावरील एन्झाइम पेशीबाहेर निळ्या रंगद्रव्याचे अपचयन करून त्याला रंगहीन रूपात बदलतात तेव्हा फेरिसायनाइड ते इलेक्ट्रॉन पुन्हा घेऊ शकते. त्यामुळे रंगद्रव्याने पटल ओलांडण्यापूर्वीच माध्यमात निळे रंगद्रव्य पुन्हा तयार होते. फेरिसायनाइड जास्त प्रमाणात उपस्थित असेपर्यंत (10 micromolar रंगद्रव्याच्या तुलनेत 50 ते 500 micromolar फेरिसायनाइड), रंगद्रव्याचे ग्रहण जवळजवळ थांबले होते. फेरिसायनाइड पूर्ण वापरले गेल्यानंतरच ग्रहण नेहमीच्या वेगाने पुन्हा सुरू झाले. अभिक्रियेच्या गतिकीनेही हाच निष्कर्ष दुसऱ्या प्रकारे दर्शवला. फेरिसायनाइड साधारण स्थिर वेगाने कमी होत गेले; हे पुन्हा वापरता येणाऱ्या मध्यस्थाला पुरवठा करणाऱ्या स्थिर पृष्ठभागीय अपचयन प्रवाहाशी सुसंगत होते. त्याच वेळी पेशीबाहेरील रंगद्रव्याचा साठा कमी होत गेल्याने त्याचे प्रमाण घातांकीय पद्धतीने घटले. स्थिर प्रवाह आणि कमी होत जाणारा साठा यांचा एकत्रित अर्थ असा की फेरिसायनाइडचा संकेत सतत होणारे अपचयन दर्शवतो, द्रावणातून बाहेर पडणारे रंगद्रव्याचे रेणू नव्हे.
दुसऱ्या साधनाने पटल ओलांडण्याची पायरीच पूर्णपणे काढून टाकली. संशोधकांनी थायाझीन कुटुंबातील जवळचे रंगद्रव्य टोल्युइडीन ब्लू O एका मोठ्या पॉलीअ‍ॅक्रिलामाइड साखळीला जोडले. ही साखळी कोणत्याही ऑक्सिडीकरण अवस्थेत पेशीत प्रवेश करण्यासाठी खूप मोठी होती. तरीही पेशींनी या जोडलेल्या रंगद्रव्याचे अपचयन केले. त्यामुळे अपचयनासाठी पेशीच्या आतील भागात प्रवेश आवश्यक नाही. ही यंत्रणा पृष्ठभागावर उपलब्ध असते किंवा त्याच्याशी विद्युतदृष्ट्या जोडलेली असते.
त्यानंतर संशोधनलेखाच्या शीर्षकाचा आधार असलेला टप्प्यांतील फरक स्पष्ट झाला. 2 millimolar सांद्रतेतील सायनाइड आणि अझाइड यांनी रंगद्रव्याचे संचयन मोठ्या प्रमाणात दडपले. सूक्ष्मदर्शकाखाली, सामान्यतः केंद्रकाभोवती दिसणारे गडद निळे आणि जांभळे अंतःकण जवळजवळ नाहीसे झाले. तरीही दोन्ही अवरोधकांपैकी कोणत्याही अवरोधकाने पेशीबाहेरील अपचयन मंदावले नाही: फेरिसायनाइडचे चक्रण कोणतीही घट न होता सुरू राहिले आणि पटलातून न जाणाऱ्या पॉलिमरचेही अपचयन होत राहिले. अडथळा पुढील टप्प्यावर होता. सायनाइड आणि अझाइड पेशींतर्गत पुनःऑक्सिडीकरण आणि वेगळे अडकवून ठेवणे थांबवत होते, पृष्ठभागावरील अपचयन नव्हे. पेशींच्या जीवक्षमतेच्या नियंत्रण चाचण्यांनी या निष्कर्षाला आधार दिला. या प्रक्रियांदरम्यान पेशींनी आपले सायटोसोलमधील निदर्शक एन्झाइम लॅक्टेट डिहायड्रोजनेज टिकवून ठेवले होते; त्यामुळे ग्रहण कमी होण्याचे कारण केवळ विषारी परिणाम किंवा पटल फुटणे नव्हते.
त्या संशोधनलेखातील एक सावधगिरी आजही लागू होते. निळे अंतःकण केंद्रकाच्या भोवती होते, केंद्रकात नव्हते; हे पेशीअंगकांच्या आत होणाऱ्या ऑक्सिडीकरणाशी सुसंगत होते. मात्र कोणती पेशीअंगके होती, हे अभ्यासाने ओळखले नाही. इतर पेशीप्रकारांतील अशाच नमुन्यांना अल्प पुराव्यावरून लायसोसोमीय म्हटले गेले होते. अडकण्याची प्रक्रिया सिद्ध मानावी, पण तिचे नेमके स्थान तात्पुरता निष्कर्ष मानावे. इलेक्ट्रॉन पुढे कुठे जातात, याचा मागोवा घेणारे वाचक माइटोकॉन्ड्रियातील इलेक्ट्रॉन वाहतूक आणि रेडॉक्स व्यवस्थापन आणि मार्गानुसार शोषण व वितरण यांचे व्यापक चित्र पुढे पाहू शकतात.
रंगांकन म्हणजे संपर्काचे प्रमाण नव्हे
ग्रहणाची ही प्रक्रिया जैविक मापनाशी जोडली गेल्यावर काय घडते, हे तिसरा अभ्यास दाखवतो. स्कॉट आणि त्यांच्या सहकाऱ्यांना आढळले की वलयाकार साखरेची रचना असलेले मिथाइल बीटा सायक्लोडेक्स्ट्रिन थेट मेथिलीन ब्लूला बांधते. अंतर्भाव संकुलासाठी त्याचा संयोग स्थिरांक सुमारे 310 per molar होता, तर रंगद्रव्याच्या द्वितयीकरणासाठी तो सुमारे 5846 per molar होता. L929 फायब्रोब्लास्टमध्ये या बंधनामुळे पेशींचे रंगांकन आणि ग्लुकोज ग्रहणाला मिळणारी चालना, दोन्ही रोखले गेले: सायक्लोडेक्स्ट्रिनसोबत आधी उष्मायन केल्यास निळे रंगांकन झाले नाही, तर ते नंतर घातल्यास रंग उतरण्याचा वेग वाढला. पेशींमधून प्रकाशीय निळा संकेत कमी होत गेला तसतशी वाढलेली ग्लुकोज वाहतूकही अगदी समांतरपणे कमी झाली.
लेखकांनी या सहसंबंधाचा अर्थ असा लावला की दीर्घकाळ टिकणाऱ्या ऑक्सिडेटिव्ह ताणाच्या यंत्रणेपेक्षा, रंगद्रव्य आणि ग्लुकोज वाहक सक्रिय करणाऱ्या मार्गातील एखादे प्रथिन यांच्यातील थेट परस्परक्रियेला अधिक आधार मिळतो. हा निष्कर्ष वाजवी आहे, पण त्याला मर्यादा आहेत. प्रयोग त्या प्रथिनाची ओळख सांगत नाही, वाहकाशीच बंधन होते असे दाखवत नाही, आणि रंग उतरणे व परिणाम कमी होणे यांतील सहसंबंधामुळे रेडॉक्समार्फत होणारा प्रत्येक संभाव्य मार्ग नाकारता येत नाही.
यातून मिळणारा टिकाऊ धडा मापनाविषयी आहे. प्रकाशीय रंगांकन दृश्यमान, ऑक्सिडीकृत आणि पेशीशी संबंधित रंगद्रव्य दर्शवते. रंगहीन अपचयित साठा त्यात अजिबात दिसत नाही. त्यामुळे फिकट दिसणाऱ्या पेशीतही रंगद्रव्याची समतुल्ये असू शकतात, आणि गडद रंगलेली पेशी एकूण ऊतींतील संपर्काचे प्रमाण किंवा परिणामाची व्याप्ती दर्शवण्याऐवजी अडकलेले ऑक्सिडीकृत रंगद्रव्य दर्शवते. हीच सावधगिरी मोठ्या स्तरावरही लागू होते: वेगवेगळ्या पेशीप्रकारांतील रंगांकनाची तुलना करणे किंवा गडद ऊतीच्छेदाला अधिक संपर्काच्या प्रमाणाचा पुरावा मानणे म्हणजे पात्रातील निरीक्षणाची मूळ चूक पुन्हा करणे. ग्रहण हे अपचयन, विसरण आणि पुनःऑक्सिडीकरणाचे चक्र आहे, आणि निळ्या रूपाचे कोणतेही एका क्षणाचे चित्र त्याचा केवळ एक भाग दाखवते. प्रयोगशाळेतील रंगांकन आणि हाताळणी तसेच मात्रा आणि संपर्काच्या प्रमाणाविषयीच्या दाव्यांचा अर्थ लावणे यांसाठीचे व्यावहारिक परिणाम यातून थेट स्पष्ट होतात.