Микроскопид метилен хөхийг орлуулах хувилбарууд

Энгийн бактерийн түрхцэд эсийн хэлбэрийг харах зорилготой бол метилен хөхийн оронд кристалл виолет хэрэглэж болно. Амьд эсийн хувьд огт будаг хэрэглэхгүй фазын контрастын арга илүү тохиромжтой хувилбар байж болно. Сонголт нь ямар ажиглалт хийх шаардлагатайгаас хамаарна.

Хоёр хүн нэг бактерийн өсгөврийг шинжилж байна гэж төсөөлье. Нэг нь савхан хэлбэрийн эсүүдийг бөөрөнхий эсүүдээс ялгахыг хүсэж байна. Нөгөө нь тодорхой боловсруулалт бактерийг устгасан эсэхийг мэдэхийг хүсэж байна. Эхний хүнд тод дүрс өгдөг будаг хоёр дахь хүнд ашиглаж болохуйц хариу өгөхгүй байж болно.

Орлуулагч сонгохын өмнө энэ өгүүлбэрийг гүйцээнэ үү: “Би ___ доторх ___-ийг ажиглах хэрэгтэй бөгөөд эсүүд амьд хэвээр үлдэх ёстой / шаардлагагүй.” Энэ өгүүлбэр нь будаг ямар үүрэг гүйцэтгэх ёстойг тодорхойлно.

Сорьц болон асуултаас эхэл

Эхлээд эсүүд амьд хэвээр үлдэх шаардлагатай эсэхийг шийдээд, дараа нь ажиглах шаардлагатай шинжийг тодорхойл:

Эсүүд амьд хэвээр үлдэх ёстой: хөдөлгөөн эсвэл хэлбэрийг ажиглах бол будаагүй фазын контраст эсвэл DIC-ийг авч үз; цөмийн DNA-г ажиглах бол флюресценцийн Hoechst 33342-ийг авч үз; мембраны бүрэн бүтэн байдлыг үнэлэх бол SYTO 9-ийг propidium iodide-той хослуулсан зэрэг баталгаажуулсан шинжилгээг сонго.
Эсүүд амьд хэвээр үлдэх шаардлагагүй: бактерийн морфологид кристалл-виолетын энгийн будаг эсвэл нигрозины сөрөг будалтыг авч үз; Gram урвалд Gram будалтын бүрэн аргыг ашигла; бэхжүүлсэн эсийн цөмийн DNA-д DAPI флюресценцийг авч үз.

Салбар бүрийн хязгаарлалтыг харьцуулахын тулд энэ хүснэгтийг ашигла. Эдгээр нь арга сонгох хувилбарууд болохоос одоо хэрэглэж буй протокол дотор нэг савтай урвалжийг нөгөөгөөр солих заавар биш.

Юуг ажиглах шаардлагатай	Сорьц ба төхөөрөмж	Боломжит хувилбар	Гол хязгаарлалт
Бактерийн хэлбэр ба байрлал	Бэлтгэсэн бактерийн түрхэц; brightfield	Кристалл виолетын энгийн будаг	Морфологийг харуулна; Gram урвал эсвэл амьдрах чадварыг тогтоохгүй.
Харанхуй дэвсгэр дээрх эсийн хүрээ	Бактериологийн бэлдмэл; brightfield	Нигрозины сөрөг будаг	Бэлтгэл болон найрлага чухал; будаагүй эс заавал амьд гэсэн үг биш.
Gram урвал	Бэлтгэсэн бактерийн түрхэц; brightfield	Gram будалтын бүрэн арга	Урвалжийн бүрэн дараалал болон хяналт шаардлагатай.
Амьд эсийн хөдөлгөөн эсвэл өөрчлөлт	Тохирох нойтон бэлдмэл; фазын контраст эсвэл DIC	Будаггүй	Тохирох оптик шаардлагатай; контраст нь тодорхой молекулыг танихгүй.
Цөмийн DNA	Бэхжүүлсэн эсүүд; флюресценц	DAPI	Тохирох өдөөлт болон цацралын шүүлтүүр шаардлагатай.
Амьд эсийн цөмийн DNA	Амьд эсүүд; флюресценц	Hoechst 33342	Эсэд нэвтэрч байгаа нь дүрслэлийн нөхцөл хор нөлөөгүйг тогтоохгүй.
Бактерийн мембраны бүрэн бүтэн байдал	Бэхжүүлээгүй бактери; флюресценц	SYTO 9-ийг propidium iodide-той хамт	Мембраны будалт нь амьдрах чадварын шууд бус хэмжүүр.

Энгийн түрхцийн хувьд аргыг болгоомжтой орлуул

Бактерийн морфологийг нэг өнгөөр харах зорилготой үед кристалл виолет нь практик сонголт юм. FDA-ийн Bacteriological Analytical Manual-д энгийн будалтад тохирох кристалл виолетын хоёр найрлага жагсаасан байдаг. Баримтжуулсан найрлага болон түүнд тохирох бэлтгэх аргыг ашигла; зөвхөн будгийн нэр нь хэрэглэхэд бэлэн урвалжийг бүрэн тодорхойлохгүй.

Кристалл виолет нь Gram будалтад мөн ордог боловч үүнээс болж кристалл виолетын энгийн будалт Gram будалт болчихгүй. ASM-ийн Gram будалтын протоколд ялгах үр дүн нь кристалл виолет, иод, өнгө арилгалт, эсрэг будалт дарааллаар үйлчилснээс хамаардаг. Эдгээр алхмыг хасвал дүрсээр тогтоож болох зүйл өөрчлөгдөнө. Энэ ялгааг энгийн будалт ба Gram будалтын харьцуулалт-аас үзнэ үү.

Нигрозин нь хүрээг өөр аргаар тодруулдаг: дэвсгэрийг бараан болгож, бактерийн эсүүдийг харьцангуй цайвар хэвээр үлдээнэ. Орлуулагчдын ерөнхий жагсаалтад орхигдож болох нэг чухал мэдээлэл Merck-ийн нигрозины зааварт бий. Түүний заасан ажлын найрлагад формальдегид ордог. Тиймээс эсүүд өөрсдөө будаагүй мэт харагддаг байсан ч “сөрөг будаг” гэсэн нэрээс нь амьд эстэй нийцтэй гэж дүгнэж болохгүй. Бүрэн найрлага болон сорьцын бэлтгэлийг шалга.

Амьд сорьцод оптикийг өөрчлөхийг авч үз

Хэрэв эсүүдийн хөдөлгөөн эсвэл хуваагдлыг ажиглахыг хүсэж байвал өөр будаг нэмэх нь ажиглалтыг төвөгтэй болгож болно. Nikon-ийн тунгалаг сорьц дахь контрастын гарын авлагад тайлбарласнаар фазын контраст болон differential interference contrast буюу DIC нь сорьцын оптик шинж чанарын ялгааг ашиглан тэдгээрийг харагдахуйц болгодог. Микроскоп шаардлагатай бүрэлдэхүүн хэсгүүдтэй бол эдгээр аргаар амьд, будаагүй эсүүдийг харж болно.

Энэ сонголт нь бэлдмэлийг будаагүй хэвээр үлдээдэг ч олж авах мэдээллийг өөрчилнө. Аль молекул контрастыг үүсгэснийг мэдэхгүйгээр эсийн хил эсвэл хөдөлгөөнийг даган ажиглаж болно. Хэрэв молекулын байршлыг тогтоох нь гол асуулт бол тохирох тэмдэглэгээний аргыг сонго.

Цөмийн DNA-ийн хувьд Invitrogen-ийн DAPI болон Hoechst будгийн харьцуулалт нь DAPI-г бэхжүүлсэн эсүүдэд түгээмэл хэрэглэдэг бол эсэд илүү сайн нэвтэрдэг Hoechst 33342-ийг амьд эсийн тэмдэглэгээнд илүүд үздэг гэж ялган тайлбарладаг. Аль аль нь флюресценцийн төхөөрөмж шаарддаг. Аль нь ч өнгөт brightfield будгийн шууд орлуулалт биш.

Будгийн үйлчлэл болон гэрэлтүүлгийг туршилтын нөхцөл гэж үз. Хэрэв эсийн зан төлөвийг хэмжиж байгаа бол будсан болон будаагүй бэлдмэлүүдийг харьцуул.

Улаан эс автоматаар үхсэн эс гэсэн үг биш

SYTO 9 болон propidium iodide-ийг бактерийн мембраны бүрэн бүтэн байдлыг үнэлэхэд ихэвчлэн хослуулан ашигладаг. BacLight гарын авлага бүрэн бүтэн мембраныг ногоон будалттай, гэмтсэн мембраныг улаан будалттай холбон тайлбарладаг. Энэ тайлбарыг тухайн сорьцод баталгаажуулах шаардлагатай.

Rosenberg болон хамтран ажиллагчдын 2019 оны судалгаа энэ асуудлыг харуулдаг. Фосфат-буферт давсны уусмал дахь шилэн гадаргуу дээрх 24-hour E. coli биофильмд эсүүдийн ойролцоогоор 96% нь in situ нөхцөлд propidium-iodide-positive мэт харагдсан. Гэвч хураан авсны дараа зохиогчид 82% нь өсгөвөрлөх боломжтой гэж тооцсон. Конфокал дүрслэлд улаанаар будагдсан материалын доор дотор хэсэг нь ногоон эсүүд харагдсан нь төөрөгдүүлсэн дохионд эсийн гаднах нуклейн хүчлүүд оролцсоныг示нэ.

Эдгээр хувь хэмжээ нь бүх тохиолдолд хэрэглэж болох засварын коэффициент биш, харин судалгааны бэлдмэлүүд дээр хийсэн өөр өөр хэмжилтүүдийг илэрхийлнэ. Практик сургамж нь дохиог яг юу үүсгэснийг шалгах явдал юм. Биофильмд нуклейн хүчилтэй холбогдох будаг нь гэмтсэн эсийн доторх материалаас гадна эсийн гаднах материалыг ч илрүүлж болно. Амьдрах чадварын талаар дүгнэхдээ судлаачид өсгөвөрлөлт эсвэл бодисын солилцооны идэвх зэрэг нэмэлт хэмжилт хэрэглэхийг зөвлөсөн бөгөөд арга бүр өөрийн хязгаарлалттайг мөн тэмдэглэсэн.

Орлуулах арга үнэхээр юу агуулдгийг шалга

Орлуулах будалтын арга нь метилен хөх агуулсан хэвээр байж болно. Giemsa үүний нэг жишээ: Merck өөрийн бүтээгдэхүүнийг цус болон ясны чөмөгний түрхэц зэрэг хэрэглээнд зориулагдсан azure-eosin-methylene-blue уусмал гэж тодорхойлдог. Энэ нь өөр төрлийн сорьцод зориулсан өөр арга байж болох ч метилен хөхийг бүрэн хасах шаардлагыг хангахгүй.

Хэрэв тодорхой нэгдлийг хасах нь туршилтын нэг хэсэг бол дүрсийг харьцуулахаасаа өмнө урвалжийн таних мэдээлэл болон найрлагыг шалга. Methyl blue, methylene blue болон ижил төстэй нэртэй будгуудын гарын авлагад нэршлийн ялгааг тайлбарласан.

Үр дүнг ашиглахаас өмнө орлуулалтыг баталгаажуул

Шинэ аргын хувьд төлөөлөхүйц сорьцууд болон тохирох хяналтыг ашиглан жижиг хэмжээний харьцуулалт хий. Боломжтой бол микроскопын тохиргоог харьцуулж болохуйц хэвээр хадгал. Илүү сайн харагдсан дүрсийг зүгээр илүүд үзэх бус, шалтгааныг нь шинжлэх боломжтой байлгахын тулд урвалжийн найрлага, сорьцын бэлтгэл, үйлчлэлийн хугацаа болон дүрслэлийн нөхцөлийг тэмдэглэ.

Амжилтыг анхны асуулттай харьцуулан үнэл. Морфологийн хувьд эсийн хил болон байрлалыг тайлбарлах боломжтой хэвээр эсэхийг үнэл. Цөмийн тэмдэглэгээнд дохионы байршил болон дэвсгэрийг үнэл. Амьдрах чадварын хувьд өнгөний ялгаралт харагдахуйц байгаагаас илүү нотолгоо шаард. Метилен хөхийн будалт болон лабораторийн хэрэглээний өргөн хүрээний гарын авлагад ажиглалт болон бэлтгэл хоорондоо хэрхэн уялддагийг тайлбарласан.

Шаардлагатай хэмжилтийг хэвээр хадгалдаг хувилбарыг сонго. Өнгө бол гарсан дүрсний зөвхөн нэг шинж чанар юм.