Метиленийн хөх митохондрийн III комплексийг тойрч чадах уу? Судалгааны үр дүн яагаад зөрдөг вэ

Хоёр лаборатори метиленийн хөх хориглогдсон митохондрийн III комплексийг тойрч чадах эсэхийг судалжээ. Нэг нь үгүй гэж хариулсан. Нөгөө нь тийм гэж хариулсан. Аль аль нь өгөгдөлтэй байв.

Хулганы тархины митохондри дээр хийсэн эхний судалгаа энэ будаг тойрч чадахгүй гэж тогтоосон. Гурван зүйлийн мэрэгчийн тархины митохондри дээр хийсэн хоёр дахь судалгаа хэсэгчлэн тойрч чадна гэж тогтоожээ. Хулганы элэг дээр хийсэн гурав дахь судалгааг эдгээртэй хамтатган эшлэх нь элбэг боловч тэр нь өөр зүйл шалгасан. Түүнийг зөв хүрээнд нь авч үзвэл будлианы тал нь арилна.

Бүх нөхцөлд үйлчлэх нэг механизм зарлах үндэс энд байхгүй. Харин өөр өөр хориглогч, тун, хэмжилтийн үзүүлэлттэй гурван туршилт бий. Эхлээд нөхцөлийг нь унш. Дүгнэлт нь түүнээс гарна.

Энд тойрох гэдэг нь юу гэсэн үг вэ

Электронууд гинжид I комплексээр дамжин NADH-аас, эсвэл II комплексээр дамжин сукцинатаас орж, III комплексээр дамжин цитохром c-д хүрээд, дараа нь IV комплексээр дамжин хүчилтөрөгчид очдог. Энэ замд үүссэн градиентыг эс ATP үүсгэхэд ашигладаг.

Тойрох тухай тайлбар нь метиленийн хөх хоригийн өмнөх хэсгээс электрон авч, хоригийн дараах хэсэгт өгдөг гэсэн санаа юм. Исэлдсэн будаг NADH эсвэл гинжийн эхэн хэсгийн бүрэлдэхүүнээс электрон авч, лейкометиленийн хөх болж хувирна. Дараа нь энэ ангижирсан хэлбэр электронуудаа цитохром c-д өгөх эсвэл гинжид буцаан оруулна. Хэрэв электрон дамжуулалт хоригийн дараах хэсэгт хүрвэл амьсгал ба мембраны потенциал хэсэгчлэн сэргэнэ. Харин хоригийн байрлалд эсвэл түүнээс өмнөх хэсэгт хүрвэл юу ч сэргэхгүй.

III комплексийн нэг онцлог энэ маргааны ихэнхийг шийддэг. Тус комплекс дарангуйлагч холбогдох хоёр байрлалтай Q мөчлөгөөр ажилладаг. Антимицин Qi байрлалд холбогдоно. Миксотиазол Qo байрлалд холбогдоно. Эдгээрийн зөвхөн нэгийг ашигласан судалгаа комплексийн зөвхөн нэг талыг шалгасан гэсэн үг.

Нэгдүгээр судалгаа: хулганы тархины митохондрид тойрох зам илрээгүй

Gureev болон хамтран ажиллагчид C57BL/6 хулганы тархины бор гадаргын митохондрийг дигитониноор тусгаарлаж, уургийн 0.1 mg per ml концентрацтайгаар шинжилжээ. Субстратыг гурван хувилбараар хэрэглэсэн: пируват ба малат тус бүр 5 mM, сукцинат 10 mM ба глутамат 2 mM, мөн L-пролин 10 mM. Хориглогч нь 1 micromolar ротенон (I комплекс) болон 1 microgram per ml антимицин (III комплекс) байв. Будгийн тун 0.5, 1, 2 micromolar байсан бөгөөд үндсэн концентрацыг 1 micromolar болгожээ. Аргачлал болон хэмжилтийн муруйнуудыг FEBS Letters сэтгүүлийн өгүүллээс үзэж болно.

I комплексийг тойрох зам ажилласан. Ротенон ADP-ээр өдөөгдсөн амьсгалыг ойролцоогоор 121-ээс 2 nmol per minute per mg болгон бууруулсан бөгөөд 1 micromolar будаг үүнийг ойролцоогоор 21 болгон сэргээжээ. Пируват ба малат, мөн L-пролин хэрэглэсэн үед мембраны потенциал сэргэсэн.

III комплексийг тойрох зам ажиллаагүй. Антимицин амьсгалыг ойролцоогоор 16 болгон бууруулсан бөгөөд будаг үүнийг ердөө 20 орчим болгожээ. Будгийн тунг 5 micromolar хүртэл нэмэгдүүлэхэд ч аль ч субстратын нөхцөлд мембраны потенциал сэргээгүй. Пероксидын өгөгдөл мөн адил чиглэл заасан: будаг дангаараа пероксид ялгарах суурь хурдыг ойролцоогоор 76 pmol per minute per mg-аас гурван тунгийн үед тус тус 1170, 1460, 1945 орчим болгож нэмэгдүүлсэн. Гэтэл антимицин будаг өдөөсөн тэр дохиог тус тус ойролцоогоор 25, 88, 96 хувиар бууруулжээ. Хэрэв ангижирсан будаг хүчилтөрөгчтэй шууд урвалд ордог бол III комплексийг хориглох нь дохиог дарах ёсгүй. Зохиогчид ангижирсан будаг антимицинээр хориглосон хэсгийн өмнө, III комплексийн Qo байрлалд исэлддэг гэж дүгнэсэн. Энэ богино эргэлтийг үгээр илэрхийлбэл: электрон өгөгчөөс будагт, будгаас Qo-д, цааш хэвийн замаар. Ротеноны хоригийг тойрно. Антимицины хоригийг тойрохгүй.

Хоёрдугаар судалгаа: гурван зүйлд, дарангуйлагчийн хоёр байрлалын аль алинд нь хэсэгчлэн тойрсон

Svab болон хамтран ажиллагчид туршилтын загварыг өргөжүүлжээ. Хулгана, харх, далайн гахайн тархины митохондрийг Percoll-оор тусгаарлаж, мөн 0.1 mg per ml концентрацтайгаар, пируват ба малат эсвэл глутамат ба малатыг тус бүр 5 mM-аар хэрэглэн шинжилсэн. Тэд III комплексийн хоёр хориглогч ашигласан: 0.3 micromolar антимицин A болон 1 micromolar миксотиазол. Ихэнх шинжилгээнд будгийг 2 micromolar, цитохром c-ийн туршилтад 0.5-аар хэрэглэжээ. Гурван зүйлд ижил протоколоор хийсэн туршилтыг нээлттэй хандалттай өгүүллээс үзэж болно.

Гурван зүйлийн аль алинд хоёр хоригийг хэсэгчлэн тойрсон. Хулганы митохондрид антимицин амьсгалыг дарангуйлсан бөгөөд будаг үүнийг ойролцоогоор 60 хувиар, 37 орчмоос 59 nmol per minute per mg болгон нэмэгдүүлжээ. Миксотиазол амьсгалыг 88 хувиар дарангуйлж, ойролцоогоор 4.5 болгосон бол будаг тав дахин нэмэгдүүлж, 23 орчим болгосон. Аль ч дарангуйлагчийн үед мембраны потенциал хэсэгчлэн дахин туйлширсан. Үүнийг оптик артефактыг үгүйсгэхийн тулд хоёр будаг буюу сафранин O болон харьцаат хэмжилтийн TMRM-аар хэмжжээ.

Энэ өгүүлэлд электрон дамжуулалтыг мөн шууд шалгасан бөгөөд эхний судалгаа үүнийг огт хийгээгүй. Гаднаас нэмсэн 25 micromolar ацетилжуулсан цитохром c нь дарангуйлагчтай болон дарангуйлагчгүй аль ч нөхцөлд энергижсэн митохондриор ангижраагүй. Харин будаг нэмэхэд хоёр нөхцөлд хоёуланд нь ангижрал явагдсан. Эсгүй буфер орчинд NADH ба будаг цитохром c-ийг NADH-ийн хэмжээнд пропорционал хурдаар ангижруулжээ. Илүү хол хэсгийг алгасах энэ замыг үгээр илэрхийлбэл: ангижруулах эквивалентууд будагт, будаг шууд цитохром c-д, IV комплексээр дамжин хүчилтөрөгчид. Энэ зам III комплексийг бүхэлд нь алгасдаг тул хоёр хориглогчийн аль алиныг тойрох боломжтой.

Нэмэлт хоёр хэмжилт энэ тайлбарыг дэмждэг. Миксотиазолоор үйлчилсэн митохондрид будаг нэмэхэд NAD(P)H-ийн флуоресценц буурсан нь ангижруулах эквивалентууд шинэ замаар зарцуулагдсаныг илтгэнэ. Мөн 660 nm дахь будгийн шингээлт нэмэлт бүрийн дараах өөрчлөлтийг харуулсан. Центрифугдсаны дараах дээд шингэний шинжилгээгээр исэлдсэн будаг энергижсэн митохондрийн дотор зуу гаруй дахин баяжиж, потенциал алдагдахад гадагшилсан нь тогтоогджээ. Протоны тооцоо ч үүнтэй нийцнэ: протон шахах шатуудыг алгассанаар нэг хос электронд 10 бус, ойролцоогоор 2 протон ногдоно. Тиймээс хүчилтөрөгчийн хэрэглээ хурдассан атлаа зөвхөн хэсэгчлэн дахин туйлшрах нь бодит тойрох замын шинж болохоос түүний эсрэг нотолгоо биш.

Ижил бэлдмэлээс гарсан зарим хариу өөрчлөлтийг өнгөц уншвал буруу ойлгохоор байв. Дарангуйлагч ба будаг хамт байх үед ADP амьсгалыг нэмэгдүүлэхийн оронд бууруулж, зөөвөрлөлтийг хориглох нь удаашруулахын оронд өдөөсөн. Гэсэн ч мембраны потенциал хэвийн чиглэлээр өөрчлөгдсөн хэвээр байв. Энэ системд хүчилтөрөгчийн хэрэглээг дангаар нь авч үзвэл төөрөгдөнө.

Гуравдугаар судалгаа: III бус, I ба II комплексийг шалгасан элэгний судалгаа

Lee болон Boelsterli хулганы элэгний митохондри болон өсгөвөрлөсөн гепатоцит ашиглажээ. Эдгээрийг эфавирензээр (I комплекс, IC50 нь ойролцоогоор 30 micromolar) болон изониазидын метаболит болох гидразинаар (II комплекс, IC50 нь ойролцоогоор 30 micromolar) гэмтээсэн байв. Ойролцоогоор 30 micromolar будаг NADH-ийн исэлдэлт, мембраны потенциал, ATP-ийг сэргээхийн зэрэгцээ исэлдүүлэгчид болон үхжилт үхлийг бууруулжээ. Redox Biology сэтгүүлийн өгүүлэлд үүнийг будаг гэмтсэн I ба II комплексийг тойруулан электрон зөөвөрлөдөг гэсэн загвараар тайлбарласан.

Энэ үр дүн нь гинжийн өмнөх хэсэгт тогтоогдсон үйл явцын талаарх суурь мэдээлэл юм. Харин III комплексийн талаар юу ч хэлэхгүй, учир нь тэнд ямар нэг хориг тавиагүй. Тиймээс тархины хоёр судалгааны алийг нь ч батлах эсвэл няцаах боломжгүй.

Нөхцөлийн харьцуулсан хүснэгт

III комплексийн хоёр судалгаа өөр өөрийн нөхцөлд зөв байж болох дөрвөн шалтгаан

1. Хориглогчоор хийсэн үйлчлэл ижил байгаагүй. Нэг талд 1 microgram per ml антимицин дангаар, нөгөө талд 0.3 micromolar антимицин болон тусдаа Qo байрлалын хориглогч хэрэглэсэн. Электроныг Qo байрлалд хүргэдэг будгийн зам бүтэлгүйтэх тэр нөхцөлд шууд цитохром c-д хүргэдэг зам амжилттай ажилладаг. Нэг байрлал хоёр байрлалыг хоёуланг нь төлөөлж чадахгүй.

2. Будгийн тун болон хэмжилтийн хугацаа ялгаатай байв. Үндсэн концентрацууд нь 1 ба 2 micromolar байсан. Исэлдэн ангижрах мөчлөгт ордог энэ бодисын митохондрид орох явц болон цитохром c-ийг шууд ангижруулах үйлдэл концентраци, хугацаанаас хамаардаг. Тунгийн багахан зөрүү, хэмжилтийн хугацааны ялгаа нийлээд нэг сүлжээний өөр өөр салааг илрүүлж болно.

3. Бэлдмэлүүд ялгаатай байв. Дигитониноор тусгаарлах болон Percoll градиентаар тусгаарлах аргууд митохондрийн давхацсан боловч ижил биш бүрдлийг сонгон авдаг. Уургийн концентраци хоёуланд нь 0.1 mg per ml байсан тул энэ хувьсагчийг хасаж болно. Харин дэд бүлгийн ялгаа болон бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг хасаж болохгүй. Зүйлийн ялгааг шалтгаан гэж сэжиглэх үндэс ч арилсан: хоёр дахь баг өөрийн ажигласан хариу өөрчлөлтийг хулганд мөн давтан гаргасан.

4. Субстратын төлөв будаг юу хийж чадахыг тогтоодог. Нэг талд субстратын гурван хувилбар, нөгөө талд NADH-тай холбоотой хосууд хэрэглэсэн. NADH-ийн нийлүүлэлт ба мембраны потенциал хамтдаа будаг хэр хурдан ангижрах, хаана хуваарилагдахыг тогтооно. Исэлдсэн цитохром c-ийн дэргэд ангижирсан будаг байхыг шаарддаг зам тэр сонголтоос шууд хамаарна.

Дараагийн тойрох тухай мэдэгдлийг хэрхэн унших вэ

Аль комплексийг, ямар дарангуйлагчаар, ямар байрлалд, ямар тунгаар хориглосныг асуу. Будгийн концентраци хэд байсан, хэмжилтийг хэзээ хийснийг асуу. Эд, зүйл, тусгаарлах арга, уургийн концентраци, субстратыг асуу. Мөн потенциал, амьсгал, исэлдэн ангижрах төлөв, шууд электрон дамжуулалтын шинжилгээ хоорондоо нийцэж байгаа эсэхийг асуу. Учир нь энд хүчилтөрөгчийн хэрэглээ дангаараа нэгээс олон удаа буруу чиглэл заасан.

Хязгаарлагдмал хүрээний дүгнэлт хүчинтэй хэвээр. Будаг I комплексийг тойрдог талаар судалгаанууд санал нэгтэй. III комплексийн хувьд 1 microgram per ml антимицин, 1 micromolar будаг хэрэглэсэн хулганы митохондрид үйл ажиллагааны тойрох зам илрээгүй. Харин 0.3 micromolar антимицин эсвэл 1 micromolar миксотиазол, 2 micromolar будаг хэрэглэсэн гурван зүйлд будгаас цитохром c-д электрон шууд дамжих замаар хэсэгчлэн тойрсон. Эдгээр өгүүлбэр хоорондоо зөрчилдөхгүй. Үүнээс өргөн дүгнэлт хийх нь туршилтын хүрээнээс хальсан таамаглал болно.

Холбогдох унших материалууд маргаантай тайлбарыг маргаангүй химийн хүрээнд авч үзэхэд тусална: электрон дамжуулалтын талаар метиленийн хөх электроныг хэрхэн зөөвөрлөдөг тухай, гинжийн өмнөх хэсэгт тогтоогдсон тохиолдлын талаар I комплексийг тойрох туршилтууд, хоёр будаг яагаад хэрэгтэй байсныг ойлгохын тулд мембраны потенциалын хэмжилт ба түүний артефактууд, мөн тун ба хугацаанаас үүдэх алдааг ойлгохын тулд исэлдэн ангижрах мөчлөгт ордог бодисуудтай лабораторид ажиллах арга барилыг уншаарай.