മൈക്രോസ്കോപ്പിക്കായി മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് പകരമുള്ളവ: പ്രവർത്തനത്തിന് അനുസരിച്ച് തിരഞ്ഞെടുക്കുക

ലളിതമായ ഒരു ബാക്ടീരിയൽ സ്മിയറിൽ, കോശങ്ങളുടെ ആകൃതി കാണുക എന്നതാണ് ലക്ഷ്യമെങ്കിൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന് പകരം ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ് ഉപയോഗിക്കാം. ജീവനുള്ള കോശങ്ങൾക്ക്, യാതൊരു സ്റ്റെയിനും ഉപയോഗിക്കാത്ത ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് മികച്ച പകരമാർഗമായിരിക്കാം. നിങ്ങൾ നടത്തേണ്ട നിരീക്ഷണമാണ് തിരഞ്ഞെടുപ്പിനെ നിർണ്ണയിക്കുന്നത്.

രണ്ട് പേർ ഒരേ ബാക്ടീരിയൽ കൾച്ചർ പരിശോധിക്കുന്നതായി കരുതുക. ഒരാൾക്ക് ദണ്ഡാകൃതിയിലുള്ള കോശങ്ങളെ വൃത്താകൃതിയിലുള്ള കോശങ്ങളിൽ നിന്ന് വേർതിരിച്ചറിയണം. മറ്റൊരാൾക്ക് ഒരു ചികിത്സ ബാക്ടീരിയയെ കൊന്നിട്ടുണ്ടോ എന്ന് അറിയണം. ആദ്യ വ്യക്തിക്ക് വ്യക്തമായ ചിത്രം നൽകുന്ന ഒരു സ്റ്റെയിൻ, രണ്ടാമത്തെ വ്യക്തിക്ക് ഉപയോഗപ്രദമായ ഉത്തരം ഒന്നും നൽകാതിരിക്കാം.

പകരക്കാരനെ തിരഞ്ഞെടുക്കുന്നതിന് മുമ്പ് ഈ വാക്യം പൂർത്തിയാക്കുക: “എനിക്ക് ___ എന്നതിൽ ___ നിരീക്ഷിക്കണം, കൂടാതെ കോശങ്ങൾ ജീവനോടെ തുടരേണ്ടതുണ്ട് / തുടരേണ്ടതില്ല.” സ്റ്റെയിൻ നിർവഹിക്കേണ്ട ജോലി ഈ വാക്യം നിർവചിക്കുന്നു.

സാമ്പിളും ചോദ്യവും മുതൽ തുടങ്ങുക

ആദ്യം കോശങ്ങൾ ജീവനോടെ തുടരേണ്ടതുണ്ടോ എന്ന് തീരുമാനിക്കുക; തുടർന്ന് നിങ്ങൾ നിരീക്ഷിക്കേണ്ട സവിശേഷത കണ്ടെത്തുക:

• കോശങ്ങൾ ജീവനോടെ തുടരേണ്ടതുണ്ട്: ചലനം അല്ലെങ്കിൽ ആകൃതി കാണാൻ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാത്ത ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റ് അല്ലെങ്കിൽ DIC പരിഗണിക്കുക; ന്യൂക്ലിയർ DNAയ്ക്കായി ഫ്ലൂറസൻസോടുകൂടിയ Hoechst 33342 പരിഗണിക്കുക; മെംബ്രേൻ അഖണ്ഡതയ്ക്കായി SYTO 9-നൊപ്പം propidium iodide പോലുള്ള സാധൂകരിച്ച അസേ തിരഞ്ഞെടുക്കുക.
• കോശങ്ങൾ ജീവനോടെ തുടരേണ്ടതില്ല: ബാക്ടീരിയൽ മോർഫോളജിക്കായി ക്രിസ്റ്റൽ-വയലറ്റ് സിംപിൾ സ്റ്റെയിൻ അല്ലെങ്കിൽ നൈഗ്രോസിൻ നെഗറ്റീവ് സ്റ്റെയിൻ പരിഗണിക്കുക; Gram പ്രതികരണത്തിനായി പൂർണ്ണ Gram-stain രീതി ഉപയോഗിക്കുക; ഫിക്സ് ചെയ്ത കോശങ്ങളിലെ ന്യൂക്ലിയർ DNAയ്ക്കായി DAPI ഫ്ലൂറസൻസ് പരിഗണിക്കുക.

ഓരോ ശാഖയുടെയും പരിമിതികൾ താരതമ്യം ചെയ്യാൻ ഈ പട്ടിക ഉപയോഗിക്കുക. ഇവ രീതികളുടെ തിരഞ്ഞെടുപ്പുകളാണ്; നിലവിലുള്ള ഒരു പ്രോട്ടോക്കോളിൽ ഒരു റീജന്റ് കുപ്പിക്ക് പകരം മറ്റൊന്ന് വെക്കാനുള്ള നിർദ്ദേശങ്ങളല്ല.

ലളിതമായ സ്മിയറിന്, രീതി ശ്രദ്ധാപൂർവ്വം മാറ്റുക

ബാക്ടീരിയൽ മോർഫോളജി ഒറ്റ നിറത്തിൽ കാണുക എന്നതാണ് ലക്ഷ്യമെങ്കിൽ ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ് പ്രായോഗികമായൊരു പരിഗണനയാണ്. FDAയുടെ Bacteriological Analytical Manual-ൽ സിംപിൾ സ്റ്റെയിനിംഗിന് അനുയോജ്യമായ രണ്ട് ക്രിസ്റ്റൽ-വയലറ്റ് ഫോർമുലേഷനുകൾ പട്ടികപ്പെടുത്തിയിട്ടുണ്ട്. രേഖപ്പെടുത്തിയ ഒരു ഫോർമുലേഷനും അതിന്റെ തയ്യാറാക്കൽ രീതിയും ഉപയോഗിക്കുക; ഡൈയുടെ പേര് മാത്രം പ്രവർത്തനക്ഷമമായ ഒരു റീജന്റിനെ നിർവചിക്കുന്നില്ല.

Gram സ്റ്റെയിനിംഗിലും ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ് ഉപയോഗിക്കുന്നു, പക്ഷേ അതുകൊണ്ട് ക്രിസ്റ്റൽ-വയലറ്റ് സിംപിൾ സ്റ്റെയിൻ Gram സ്റ്റെയിനാകുന്നില്ല. ASM Gram-stain പ്രോട്ടോക്കോളിൽ, വ്യത്യാസപ്പെടുത്തുന്ന ഫലം ക്രിസ്റ്റൽ വയലറ്റ്, അയോഡിൻ, ഡീകളറൈസേഷൻ, കൗണ്ടർസ്റ്റെയിനിംഗ് എന്നിവ ക്രമത്തിൽ പ്രവർത്തിക്കുന്നതിനെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. ആ ഘട്ടങ്ങൾ ഒഴിവാക്കുന്നത് ചിത്രത്തിൽ നിന്ന് സ്ഥാപിക്കാനാകുന്ന കാര്യങ്ങളെ മാറ്റുന്നു. ആ വ്യത്യാസത്തിന് സിംപിൾ സ്റ്റെയിനിംഗും Gram സ്റ്റെയിനിംഗും തമ്മിലുള്ള താരതമ്യം കാണുക.

അതിരുകൾ വ്യക്തമാക്കാൻ നൈഗ്രോസിൻ മറ്റൊരു രീതി നൽകുന്നു: ഇത് പശ്ചാത്തലം ഇരുണ്ടതാക്കുന്നു, അതേസമയം ബാക്ടീരിയൽ കോശങ്ങൾ താരതമ്യേന ഇളം നിറത്തിൽ തുടരുന്നു. പൊതുവായ പകരക്കാരുടെ പട്ടികയിൽ നഷ്ടപ്പെടാവുന്ന ഒരു പ്രധാന വിശദാംശം Merck-ന്റെ നൈഗ്രോസിൻ നിർദ്ദേശങ്ങളിൽ ഉണ്ട്. അതിൽ നിർദ്ദിഷ്ട പ്രവർത്തന ഫോർമുലേഷനിൽ ഫോർമാൽഡിഹൈഡ് ഉൾപ്പെടുന്നു. അതിനാൽ കോശങ്ങൾ തന്നെ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാത്തതുപോലെ കാണുന്നുവെങ്കിലും, “നെഗറ്റീവ് സ്റ്റെയിൻ” എന്ന വാക്കുകളിൽ നിന്ന് ജീവനുള്ള കോശങ്ങളുമായുള്ള അനുയോജ്യത നിഗമനം ചെയ്യാനാവില്ല. പൂർണ്ണ ഫോർമുലേഷനും സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കലും പരിശോധിക്കുക.

ജീവനുള്ള സാമ്പിളുകൾക്കായി, ഓപ്റ്റിക്സ് മാറ്റുന്നത് പരിഗണിക്കുക

കോശങ്ങൾ ചലിക്കുന്നതോ വിഭജിക്കുന്നതോ നിരീക്ഷിക്കണമെങ്കിൽ, മറ്റൊരു ഡൈ ചേർക്കുന്നത് നിരീക്ഷണത്തെ സങ്കീർണ്ണമാക്കാം. Nikon-ന്റെ സുതാര്യ സാമ്പിളുകളിലെ കോൺട്രാസ്റ്റ് മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശത്തിൽ വിശദീകരിക്കുന്നതുപോലെ, ഫേസ് കോൺട്രാസ്റ്റും differential interference contrast അഥവാ DICയും സാമ്പിളുകളുടെ ഓപ്റ്റിക്കൽ ഗുണങ്ങളിലുള്ള വ്യത്യാസങ്ങൾ ഉപയോഗിച്ച് അവയെ ദൃശ്യമാക്കുന്നു. മൈക്രോസ്കോപ്പിൽ ആവശ്യമായ ഘടകങ്ങൾ ഉണ്ടെങ്കിൽ, ജീവനുള്ളതും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാത്തതുമായ കോശങ്ങൾ ഇവയിലൂടെ കാണാം.

ഈ തിരഞ്ഞെടുപ്പ് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാത്ത തയ്യാറാക്കൽ നിലനിർത്തുന്നു, പക്ഷേ ലഭ്യമായ വിവരത്തിന്റെ സ്വഭാവം മാറ്റുന്നു. ഏത് മോളിക്ക്യൂളാണ് കോൺട്രാസ്റ്റ് സൃഷ്ടിച്ചതെന്ന് അറിയാതെയും ഒരു അതിരോ ചലനമോ പിന്തുടരാം. മോളിക്കുലാർ ലോക്കലൈസേഷനാണ് ചോദ്യം എങ്കിൽ, അതിന് അനുയോജ്യമായ ലേബലിംഗ് രീതി തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

ന്യൂക്ലിയർ DNAയ്ക്കായി, Invitrogen-ന്റെ DAPI, Hoechst സ്റ്റെയിനുകളുടെ താരതമ്യം ഫിക്സ് ചെയ്ത കോശങ്ങളോടൊപ്പം DAPI സാധാരണയായി ഉപയോഗിക്കുന്നതും, കൂടുതൽ എളുപ്പത്തിൽ കോശത്തിനുള്ളിലേക്ക് കടക്കുന്ന Hoechst 33342 ജീവനുള്ള കോശങ്ങളുടെ ലേബലിംഗിന് മുൻഗണന നൽകുന്നതുമെന്ന വ്യത്യാസം ചൂണ്ടിക്കാണിക്കുന്നു. രണ്ടിനും ഫ്ലൂറസൻസ് ഉപകരണങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്. ഇവയിൽ ഒന്നും നിറമുള്ള ബ്രൈറ്റ്ഫീൽഡ് സ്റ്റെയിനിന് നേരിട്ടുള്ള പകരമല്ല.

ഡൈ എക്സ്പോഷറും പ്രകാശനവും പരീക്ഷണ സാഹചര്യങ്ങളായി കണക്കാക്കുക. കോശങ്ങളുടെ പെരുമാറ്റമാണ് നിങ്ങളുടെ അളവെങ്കിൽ സ്റ്റെയിൻ ചെയ്തതും സ്റ്റെയിൻ ചെയ്യാത്തതുമായ തയ്യാറാക്കലുകൾ താരതമ്യം ചെയ്യുക.

ചുവന്ന കോശം സ്വതവേ മരിച്ച കോശമല്ല

ബാക്ടീരിയൽ മെംബ്രേൻ അഖണ്ഡത വിലയിരുത്താൻ SYTO 9യും propidium iodideയും പലപ്പോഴും ഒരുമിച്ച് ഉപയോഗിക്കുന്നു. BacLight മാനുവൽ അഖണ്ഡമായ മെംബ്രേനുകളെ പച്ച സ്റ്റെയിനിംഗുമായും കേടായ മെംബ്രേനുകളെ ചുവന്ന സ്റ്റെയിനിംഗുമായും ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു. ആ വ്യാഖ്യാനം ബന്ധപ്പെട്ട സാമ്പിളിനായി സാധൂകരിക്കേണ്ടതാണ്.

Rosenbergയും സഹപ്രവർത്തകരും നടത്തിയ 2019 ലെ ഒരു പഠനം ഈ പ്രശ്നം വ്യക്തമാക്കുന്നു. ഫോസ്ഫേറ്റ്-ബഫർഡ് സലൈൻ ഉള്ള ഗ്ലാസിൽ 24 മണിക്കൂർ വളർത്തിയ E. coli ബയോഫിലിമുകളിൽ, ഏകദേശം 96% കോശങ്ങളും അവ സ്ഥിതിചെയ്യുന്നിടത്ത് തന്നെ propidium-iodide-positive ആയി കാണപ്പെട്ടു. എന്നാൽ ശേഖരണത്തിനുശേഷം 82% കോശങ്ങൾ കൾച്ചർ ചെയ്യാവുന്നതാണെന്ന് ഗവേഷകർ കണക്കാക്കി. കോൺഫോകൽ ചിത്രങ്ങളിൽ ചുവപ്പ് സ്റ്റെയിൻ ചെയ്ത വസ്തുവിന് കീഴിൽ പച്ച ഉൾഭാഗമുള്ള കോശങ്ങൾ കാണപ്പെട്ടു; തെറ്റിദ്ധരിപ്പിക്കുന്ന സിഗ്നലിൽ എക്സ്ട്രാസെല്ലുലാർ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകൾക്ക് പങ്കുണ്ടെന്ന് ഇത് സൂചിപ്പിച്ചു.

ആ ശതമാനങ്ങൾ പഠനത്തിലെ തയ്യാറാക്കലുകളിൽ നടത്തിയ വ്യത്യസ്ത അളവുകളെയാണ് വിവരിക്കുന്നത്; അവ സർവസാധാരണമായ തിരുത്തൽ ഘടകമല്ല. സിഗ്നൽ എന്താണ് സൃഷ്ടിച്ചതെന്ന് പരിശോധിക്കുകയാണ് പ്രയോജനകരമായ പാഠം. ഒരു ബയോഫിലിമിൽ, ന്യൂക്ലിക്-ആസിഡ് ഡൈക്ക് കേടായ കോശങ്ങളുടെ ഉള്ളിലുള്ള വസ്തുവിനൊപ്പം കോശങ്ങൾക്ക് പുറത്തുള്ള വസ്തുവും കണ്ടെത്താൻ കഴിയും. ജീവനക്ഷമതയെക്കുറിച്ചുള്ള നിഗമനത്തിനായി, ഓരോ രീതിക്കും പരിമിതികളുണ്ടെന്ന് അംഗീകരിച്ചുകൊണ്ട് കൾച്ചറിംഗ് അല്ലെങ്കിൽ മെറ്റബോളിക് പ്രവർത്തനം പോലുള്ള പൂരക അളവുകൾ ഉപയോഗിക്കാൻ ഗവേഷകർ ശുപാർശ ചെയ്യുന്നു.

പകരമാർഗത്തിൽ യഥാർത്ഥത്തിൽ എന്താണ് അടങ്ങിയിരിക്കുന്നതെന്ന് പരിശോധിക്കുക

ഒരു പകരം സ്റ്റെയിനിംഗ് രീതിയിൽ ഇപ്പോഴും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അടങ്ങിയിരിക്കാം. Giemsa അതിന്റെ ഒരു ഉദാഹരണമാണ്: രക്തത്തിന്റെയും ബോൺ-മാരോ സ്മിയറുകളുടെയും ഉൾപ്പെടെയുള്ള ഉപയോഗങ്ങൾക്കായി ഉദ്ദേശിച്ചിരിക്കുന്ന ഉൽപ്പന്നത്തെ Merck ഒരു azure-eosin-methylene-blue solution എന്നാണ് വിവരിക്കുന്നത്. മറ്റൊരു സാമ്പിളിനായി ഇത് വ്യത്യസ്തമായൊരു രീതി ആയിരിക്കാം, എന്നാൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒഴിവാക്കണമെന്ന ആവശ്യകത ഇത് നിറവേറ്റുന്നില്ല.

ഒരു സംയുക്തത്തെ ഒഴിവാക്കുന്നത് പരീക്ഷണത്തിന്റെ ഭാഗമാണെങ്കിൽ, ചിത്രങ്ങൾ താരതമ്യം ചെയ്യുന്നതിന് മുമ്പ് റീജന്റിന്റെ തിരിച്ചറിയലും ഫോർമുലേഷനും പരിശോധിക്കുക. methyl blue, methylene blue, സമാന പേരുകളുള്ള ഡൈകൾ സംബന്ധിച്ച മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശം പേരുകളിലെ വ്യത്യാസങ്ങൾ വിശദീകരിക്കുന്നു.

ഫലം ഉപയോഗിക്കുന്നതിന് മുമ്പ് പകരമാറ്റം സ്ഥിരീകരിക്കുക

ഒരു പുതിയ രീതിക്കായി, പ്രതിനിധിയായ സാമ്പിളുകളും അനുയോജ്യമായ ഒരു കൺട്രോളും ഉപയോഗിച്ച് ചെറിയൊരു താരതമ്യം നടത്തുക. സാധ്യമെങ്കിൽ മൈക്രോസ്കോപ്പ് ക്രമീകരണങ്ങൾ താരതമ്യയോഗ്യമായി നിലനിർത്തുക. റീജന്റ് ഫോർമുലേഷൻ, സാമ്പിൾ തയ്യാറാക്കൽ, എക്സ്പോഷർ, ഇമേജിംഗ് സാഹചര്യങ്ങൾ എന്നിവ രേഖപ്പെടുത്തുക; അങ്ങനെ കൂടുതൽ ഭംഗിയായി കാണുന്ന ചിത്രം വെറും മുൻഗണന നൽകുന്നതിന് പകരം പരിശോധിക്കാനാകും.

ആദ്യത്തെ ചോദ്യത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കി വിജയമെന്ന് വിലയിരുത്തുക. മോർഫോളജിക്കായി, കോശ അതിരുകളും ക്രമീകരണവും ഇപ്പോഴും വ്യാഖ്യാനിക്കാനാകുന്നുണ്ടോ എന്ന് വിലയിരുത്തുക. ന്യൂക്ലിയർ ലേബലിംഗിനായി, സിഗ്നലിന്റെ സ്ഥാനംയും പശ്ചാത്തലവും വിലയിരുത്തുക. ജീവനക്ഷമതയ്ക്കായി, ആകർഷകമായ നിറവ്യത്യാസത്തിന് അപ്പുറമുള്ള തെളിവ് ആവശ്യപ്പെടുക. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സ്റ്റെയിനിംഗും ലബോറട്ടറി ഉപയോഗങ്ങളും സംബന്ധിച്ച വിശാലമായ മാർഗ്ഗനിർദ്ദേശം നിരീക്ഷണവും തയ്യാറാക്കലും എങ്ങനെ തമ്മിൽ ബന്ധപ്പെടുന്നു എന്ന് വിശദീകരിക്കുന്നു.

നിങ്ങൾക്ക് ആവശ്യമായ അളവ് സംരക്ഷിക്കുന്ന പകരമാർഗം തിരഞ്ഞെടുക്കുക. ലഭിക്കുന്ന ചിത്രത്തിന്റെ ഗുണങ്ങളിൽ നിറം ഒന്ന് മാത്രമാണ്.