മെത്തിലീൻ ബ്ലൂയും ഫെറോപ്റ്റോസിസും: ഇരുമ്പ്, ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ, കോശമരണം

സ്തരത്തിന് കേടുപാടുകൾ സംഭവിക്കുന്നതുമൂലമുള്ള കോശമരണമാണ് ഫെറോപ്റ്റോസിസ്. സ്തരങ്ങളിലെ പോളിഅൺസാച്ചുറേറ്റഡ് കൊഴുപ്പുകൾ ഒരു ശൃംഖലാപ്രതികരണത്തിലൂടെ ഓക്സീകരിക്കപ്പെടുന്നു, സ്തരത്തിന്റെ പ്രവർത്തനം തകരുന്നു, കോശം മരിക്കുന്നു. ഈ രാസപ്രക്രിയയ്ക്ക് ഇരുമ്പ് ആവശ്യമാണ്. ഈ വാചകത്തിൽ ആശയം മുഴുവൻ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു; ഈ ലേഖനത്തിലെ ഓരോ കാര്യവും അതിന്റെ ഒരു ഭാഗത്തെ പരിശോധിക്കുന്നതാണ്.

ഇവിടെ ചോദ്യം കൂടുതൽ പരിമിതമാണ്: കോശപരീക്ഷണങ്ങളിൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഈ ശൃംഖലയിൽ എന്താണ് ചെയ്യുന്നത്, ആ ഫലം യഥാർഥത്തിൽ എന്താണ് കാണിക്കുന്നത്? ചുരുക്കത്തിൽ, രണ്ട് ലബോറട്ടറി പഠനങ്ങളിൽ നാനോമോളാർ സാന്ദ്രതയിലുള്ള മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയിലെ ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ കുറയ്ക്കുകയും സാധാരണയായി ഫെറോപ്റ്റോസിസ് ഉണ്ടാക്കുന്ന പ്രേരകങ്ങൾ നൽകിയശേഷവും കോശങ്ങളെ ജീവനോടെ നിലനിർത്തുകയും ചെയ്തു. വിശദമായ ഉത്തരം കൂടുതൽ പ്രധാനമാണ്, കാരണം ശൃംഖലയിലെ ഓരോ കണ്ണിയും വ്യത്യസ്ത ഇടപെടലിലൂടെയാണ് പരിശോധിച്ചത്; ഓരോ ഇടപെടലിനും പരിമിതികളുമുണ്ട്.

ഫെറോപ്റ്റോസിസ് ഒരു ഖണ്ഡികയിൽ

പോളിഅൺസാച്ചുറേറ്റഡ് ഫാറ്റി ആസിഡ് വാൽ ഉള്ള ഒരു സ്തര ഫോസ്ഫോളിപിഡിന് ഒരു ദുർബലസ്ഥാനമുണ്ട്: എളുപ്പത്തിൽ അപഹരിക്കാവുന്ന ഹൈഡ്രജൻ ആറ്റങ്ങൾ. ഒരു റാഡിക്കൽ അവയിൽ ഒന്നിനെ അപഹരിച്ചുകഴിഞ്ഞാൽ, ലിപിഡിനോട് ഓക്സിജൻ ചേരുന്നു, ഒരു ലിപിഡ് പെറോക്സിൽ റാഡിക്കൽ രൂപപ്പെടുന്നു, ആ റാഡിക്കൽ അടുത്ത ലിപിഡിൽനിന്ന് ഹൈഡ്രജൻ അപഹരിക്കുന്നു. എന്തെങ്കിലും തടയുന്നതുവരെ ഈ പ്രതികരണം സ്തരത്തിലൂടെ വ്യാപിക്കുന്നു.

ഇത് തടയുന്ന പ്രധാന സംവിധാനം GPX4 എന്ന എൻസൈമാണ്. ഇത് ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ ഉപയോഗിച്ച് ലിപിഡ് പെറോക്സൈഡുകളെ നിരുപദ്രവമായ ലിപിഡ് ആൽക്കഹോളുകളാക്കി നിരോക്സീകരിക്കുന്നു. ലബോറട്ടറിയിലെ പ്രേരകങ്ങൾ ഈ പ്രതിരോധത്തെ നിർദിഷ്ട ഘട്ടങ്ങളിൽ ആക്രമിക്കുന്നു. എറാസ്റ്റിൻ സിസ്റ്റം xc-മൈനസ് വഴിയുള്ള സിസ്റ്റിൻ പ്രവേശനം തടയുന്നു; ഇതുമൂലം ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ സംശ്ലേഷണത്തിന് ആവശ്യമായ സിസ്റ്റീൻ കോശത്തിന് ലഭിക്കാതെ വരുന്നു. ബ്യൂത്തയോണിൻ സൾഫോക്സിമിൻ ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ സംശ്ലേഷണം നേരിട്ട് തടയുന്നു. RSL3, GPX4-നെത്തന്നെ തടയുന്നു. ഇവ മൂന്നും പെറോക്സൈഡുകൾ നീക്കം ചെയ്യപ്പെടാതെ തുടരാൻ ഇടയാക്കുന്നു. എന്നാൽ അവ പ്രവർത്തിക്കുന്നത് വ്യത്യസ്ത ഘട്ടങ്ങളിലായതിനാൽ, ഒരു പ്രേരകത്തിലൂടെ ലഭിക്കുന്ന ഫലം മറ്റുള്ളവയ്ക്കും ബാധകമാണെന്ന് സ്വമേധയാ കരുതാനാവില്ല.

ഫെറോപ്റ്റോസിസിനെ നിർവചിക്കുന്ന സവിശേഷതകളിൽ അത് അപ്പോപ്റ്റോസിസിൽനിന്ന് വ്യത്യസ്തമാണ്. ഇതിൽ കാസ്പേസ് ശൃംഖലയോ അപ്പോപ്റ്റോട്ടിക് ബോഡികളോ ഇല്ല. ഡെഫെറോക്സമിൻ പോലുള്ള ഇരുമ്പ് കീലിയേറ്ററുകളും ഫെറോസ്റ്റാറ്റിൻ-1 പോലുള്ള റാഡിക്കലുകളെ പിടിച്ചുനിർത്തുന്ന പദാർഥങ്ങളും ഇതിനെ അടിച്ചമർത്തുന്നു. ഒരു കോശമരണം വെറും നെക്രോട്ടിക് മരണമല്ല, ഫെറോപ്റ്റോട്ടിക് മരണമാണെന്ന് നിർണയിക്കാൻ ഗവേഷകർ ഉപയോഗിക്കുന്ന പ്രായോഗിക പരിശോധന ഇതാണ്. നിയന്ത്രിത കോശമരണ പാതകളുടെ വിശാലമായ പശ്ചാത്തലം ഈ വ്യത്യാസം മനസ്സിലാക്കാൻ സഹായിക്കുന്നു. കോശങ്ങൾ എളുപ്പത്തിൽ പ്രതികരണങ്ങൾക്ക് ലഭ്യമാകുന്ന ഇരുമ്പിനെ എങ്ങനെ കൈകാര്യം ചെയ്യുന്നു എന്നത്, കീലിയേഷൻ ഇത്ര നിർണായകമായ ഒരു നിയന്ത്രണപരിശോധനയാകുന്നത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് വിശദീകരിക്കുന്നു.

മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയുടെ പങ്ക്, അതിനെക്കുറിച്ച് തർക്കമുണ്ടായത് എന്തുകൊണ്ട്

മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ DNA ഇല്ലാത്ത കോശങ്ങളിലും ഫെറോപ്റ്റോസിസ് സംഭവിക്കുന്നതായി ആദ്യകാല ഗവേഷണം റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തു. മൈറ്റോകോണ്ട്രിയ നിർബന്ധമല്ലെന്ന സൂചനയായിരുന്നു അത്. മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുന്നതോ ശ്വസനപ്രക്രിയ തടയുന്നതോ സിസ്റ്റീൻ ക്ഷാമം മൂലമുള്ള ഫെറോപ്റ്റോസിസ് അടിച്ചമർത്താമെന്നും, എന്നാൽ GPX4 നേരിട്ട് തടയുന്നതുമൂലമുള്ള ഫെറോപ്റ്റോസിസിനെ അടിച്ചമർത്തില്ലെന്നും പിന്നീടുള്ള ഗവേഷണം കണ്ടെത്തി. മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയുടെ പങ്ക് പ്രേരകം, കോശത്തിന്റെ തരം, നിർണായകമായ പെറോക്സിഡേഷൻ നടക്കുന്ന സ്ഥലം എന്നിവയെ ആശ്രയിച്ചാണെങ്കിൽ, ഈ രണ്ട് ഫലങ്ങളും ശരിയാകാം.

ഈ ലേഖനത്തിന്റെ അടിസ്ഥാനമായ പഠനം, കോശത്തിലെ ഒരു പ്രത്യേക ഉപവിഭാഗത്തെ ലക്ഷ്യമിടുന്ന പ്രോബ് ഉപയോഗിച്ചാണ് ഈ തർക്കത്തെ സമീപിച്ചത്. ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ സൂചിപ്പിക്കുന്ന ഒരു റിപ്പോർട്ടറിന്റെ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയെ ലക്ഷ്യമിടുന്ന പതിപ്പാണ് MitoCLox: മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയ്ക്കുള്ളിലെ ലിപിഡ് പെറോക്സിൽ റാഡിക്കലുകളുമായി സമ്പർക്കത്തിലാകുമ്പോൾ അതിന്റെ ഫ്ലൂറസെൻസിൽ മാറ്റം വരുന്നു. എറാസ്റ്റിൻ നൽകിയ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളിൽ, കോശമരണത്തിനു മുമ്പ്, അപ്പോഴും ജീവനോടെയിരുന്ന കോശങ്ങളിൽ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ പ്രോബിന്റെ ഓക്സീകരണം പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടു. കോശസമൂഹത്തിലുടനീളം അത് ഒരേ തോതിലായിരുന്നില്ല. ഈ സമയക്രമം പ്രധാനമാണ്. മരണത്തിനു മുമ്പുള്ള പെറോക്സിഡേഷൻ മരണത്തിന്റെ കാരണമാകാൻ സാധ്യതയുള്ളതാണ്. മരിച്ച കോശങ്ങളിൽ മാത്രം അളക്കുന്ന പെറോക്സിഡേഷൻ മരണശേഷമുള്ള അവശിഷ്ടമാണ്. ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ പരിശോധനകളും ഓരോ പ്രോബും എന്താണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത് എന്നതും വിശദീകരിക്കുന്ന അനുബന്ധ മാർഗദർശിക, ഒരു സിഗ്നലിന്റെ അർഥം നിർണയിക്കുന്നതിൽ പ്രോബിന്റെ സ്ഥാനം പ്രധാനമാകുന്നത് എന്തുകൊണ്ടാണെന്ന് വിവരിക്കുന്നു.

രണ്ടാമത്തെ മാതൃകയിലും ഇതേ ക്രമം കണ്ടു. ലെബർ ഹെറിഡിറ്ററി ഓപ്റ്റിക് ന്യൂറോപ്പതി ഉള്ള ഒരു രോഗിയിൽനിന്നുള്ള ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾക്ക് കോംപ്ലക്സ് I മ്യൂട്ടേഷനും അടിസ്ഥാനനിലയിൽ ഉയർന്ന ഓക്സിഡേറ്റീവ് സമ്മർദവും ഉണ്ടായിരുന്നു. ഗ്ലൂട്ടത്തയോൺ കുറച്ചപ്പോൾ അവ ഫെറോപ്റ്റോസിസ് വഴി മരിച്ചു; നിയന്ത്രണ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ അതിനെ പ്രതിരോധിച്ചു. ഇവിടെയും മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ പ്രോബിന്റെ ഓക്സീകരണമാണ് ആദ്യം സംഭവിച്ചത്. വിശദാംശങ്ങൾ ഫെറോപ്റ്റോസിസിലെ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷനെക്കുറിച്ചുള്ള ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റ് പഠനത്തിൽ ലഭ്യമാണ്.

ഈ പരീക്ഷണങ്ങളിൽ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ വരുത്തിയ മാറ്റങ്ങൾ

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒരു റെഡോക്സ് വാഹകമാണ്. അതിന്റെ ഓക്സീകരിക്കപ്പെട്ട രൂപം കോംപ്ലക്സ് I-ലെ NADH-ബന്ധിത രാസപ്രക്രിയയിൽനിന്ന് ഇലക്ട്രോണുകൾ സ്വീകരിക്കുന്നു. അതിന്റെ നിരോക്സീകരിക്കപ്പെട്ട രൂപം അവയെ സൈറ്റോക്രോം c-യ്ക്ക് നൽകുന്നു; സൈറ്റോക്രോം c അവയെ കോംപ്ലക്സ് IV-ലേക്ക് എത്തിക്കുന്നു. സാധാരണയായി ഇലക്ട്രോണുകൾ ഓക്സിജനിലേക്ക് ചോർന്ന് സൂപ്പർഓക്സൈഡ് രൂപപ്പെടുന്ന ശൃംഖലാഭാഗത്തെ ഭാഗികമായി മറികടക്കുന്ന ഒരു പാത ഇതിലൂടെ ഉണ്ടാകുന്നു. ഈ കൈമാറ്റത്തിന്റെ സമ്പൂർണ ചിത്രം അറിയാൻ ആഗ്രഹിക്കുന്ന വായനക്കാർ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയിലൂടെ ഇലക്ട്രോണുകൾ എങ്ങനെ നീക്കുന്നു എന്ന ലേഖനത്തിൽനിന്ന് തുടങ്ങണം.

എറാസ്റ്റിൻ നൽകിയ ശ്വാസകോശ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകളിൽ, 250 nanomolar സാന്ദ്രതയിലുള്ള മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ കോശങ്ങളുടെ ജീവനിലനിൽപ്പ് അളക്കുന്ന പരിശോധനയിൽ ജീവക്ഷമത നിലനിർത്തി. മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയെ ലക്ഷ്യമിടുന്ന ആന്റിഓക്സിഡന്റുകളായ SkQ1, MitoTEMPO എന്നിവയും ഇതേ ഫലം കാണിച്ചു. നിയന്ത്രണപരിശോധനകളാണ് ഈ നിഗമനത്തിന്റെ പരിധി നിർവചിക്കുന്നത്. ഫെറോസ്റ്റാറ്റിൻ-1, ആൽഫ-ടോക്കോഫെറോൾ, ഡെഫെറോക്സമിൻ എന്നിവയും സംരക്ഷണം നൽകി; ഇത് മരണം ഫെറോപ്റ്റോട്ടിക് ആയിരുന്നെന്ന് സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. ആന്റിഓക്സിഡന്റ് ഗ്രൂപ്പ് ഇല്ലാത്ത SkQ1 അനലോഗ് സംരക്ഷണം നൽകിയില്ല. അതിനാൽ, നിർദിഷ്ടമല്ലാത്ത അടിഞ്ഞുകൂടലിനേക്കാൾ റെഡോക്സ് രാസപ്രക്രിയയിലേക്കാണ് തെളിവുകൾ വിരൽചൂണ്ടുന്നത്. SkQ1 സാന്ദ്രത ഏകദേശം 200 nanomolar-ന് മുകളിലെത്തിയപ്പോൾ സംരക്ഷണം കുറഞ്ഞു. ഉയർന്ന അളവുകളിൽ ക്വിനോൺ ആന്റിഓക്സിഡന്റുകൾ ഓക്സീകരണത്തെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുമെന്ന അറിയപ്പെടുന്ന സ്വഭാവവുമായി ഇത് പൊരുത്തപ്പെടുന്നു. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിനും അളവിനെ ആശ്രയിച്ചുള്ള ഇതേ ഇരട്ടസ്വഭാവമുണ്ട്: ഈ കൾച്ചർ പാത്രങ്ങളിൽ കുറഞ്ഞ നാനോമോളാർ നിലകളിൽ അത് സംരക്ഷണം നൽകുന്നു; സാന്ദ്രത ഉയർത്തുകയോ ശക്തമായ വെളിച്ചം ഏൽപ്പിക്കുകയോ ചെയ്യുമ്പോൾ റെഡോക്സ് സൈക്ലിങ്ങിലൂടെ ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കാൻ അതിന് കഴിയും. ഇത്തരത്തിലുള്ള അളവ്-സംബന്ധമായ പശ്ചാത്തലം മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയിലെ പ്രതികരണശേഷിയുള്ള ഓക്സിജൻ സ്പീഷീസുകൾ എന്ന ലേഖനത്തിൽ വിശദീകരിക്കുന്നു.

തുടർന്ന്, വേർതിരിച്ചെടുത്ത മൈറ്റോകോണ്ട്രിയയിലെ പരീക്ഷണങ്ങൾ ROS ഉറവിടങ്ങളെ വേർതിരിച്ചു പരിശോധിച്ചു. ഫെറസ് ഇരുമ്പിന്റെ സാന്നിധ്യത്തിൽ, കോംപ്ലക്സ് I-ന് ഇലക്ട്രോണുകൾ നൽകുന്ന സബ്സ്ട്രേറ്റുകളും റോട്ടനോണും ചേർന്നപ്പോൾ പ്രോബിന്റെ ഓക്സീകരണം ഉത്തേജിപ്പിക്കപ്പെട്ടു. റോട്ടനോൺ ഫ്ലാവിൻ സ്ഥാനത്തിനു ശേഷമുള്ള ഭാഗത്തെ തടയുന്നു. അതിനാൽ അതിനു മുമ്പുള്ള വാഹകങ്ങൾ നിരോക്സീകരിക്കപ്പെട്ട നിലയിൽ തുടരുകയും മാട്രിക്സിലേക്ക് അഭിമുഖമായ ഫ്ലാവിനിൽനിന്ന് ഇലക്ട്രോണുകൾ ഓക്സിജനിലേക്ക് ചോരുകയും ചെയ്യുന്നു. കോംപ്ലക്സ് III-ന് ഇലക്ട്രോണുകൾ നൽകുന്ന സബ്സ്ട്രേറ്റുകളും ആന്റിമൈസിൻ A-യും ചേർന്നപ്പോൾ ധാരാളം ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദിപ്പിച്ചു; എന്നിട്ടും ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ ഉണ്ടാക്കിയില്ല. മൊത്തത്തിലുള്ള ROS സിഗ്നൽ ഒരേതായിരുന്നെങ്കിലും സ്ഥാനം വ്യത്യസ്തമായിരുന്നു, ഫലവും വ്യത്യസ്തമായി. ഹൈഡ്രജൻ പെറോക്സൈഡ് ഉൽപ്പാദനത്തെത്തന്നെ അടിച്ചമർത്താതെ, കോംപ്ലക്സ് I നയിക്കുന്ന പെറോക്സിഡേഷനെ SkQ1-ഉം മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും ഓരോന്നും അടിച്ചമർത്തി. അതിനാൽ അവയുടെ പ്രവർത്തനസ്ഥാനം ROS രൂപീകരണത്തിനു ശേഷമുള്ള ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷൻ ഘട്ടത്തിലാണ്.

ഇരുമ്പ് അമിതമാകുന്ന പരീക്ഷണവിഭാഗവും ലിപോഫുസിൻ നൽകുന്ന സൂചനയും

രണ്ടാമത്തെ പഠനം ഇരുമ്പിന്റെ വശത്തുനിന്നാണ് ഈ ചോദ്യം പരിശോധിച്ചത്. സബ്മില്ലിമോളാർ സാന്ദ്രതയിലുള്ള ഫെറിക് അമോണിയം സിട്രേറ്റിന് വിധേയമാക്കിയ H9c2 ഹൃദയപേശി കോശങ്ങളിൽ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ROS-ഉം മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷനും തുടർന്ന് ഫെറോപ്റ്റോസിസും ഉണ്ടായി. അതിനുശേഷം 24 മണിക്കൂറിനുള്ളിൽ ലിപോഫുസിൻ പോലുള്ള ഒരു വർണകം അടിഞ്ഞുകൂടി. പ്രായം കൂടുന്നതിനൊപ്പം അടിഞ്ഞുകൂടുന്ന, സ്വയം ഫ്ലൂറസെൻസ് പ്രകടിപ്പിക്കുന്നതും ഇരുമ്പ് അടങ്ങിയതുമായ ഓക്സീകരിക്കപ്പെട്ട ലിപിഡുകളുടെയും പ്രോട്ടീനുകളുടെയും അവശിഷ്ടമാണ് ലിപോഫുസിൻ. ഇവിടെ അത് വേഗത്തിൽ പ്രത്യക്ഷപ്പെട്ടത്, ഇരുമ്പ് മൂലം പെട്ടെന്നുണ്ടാകുന്ന പെറോക്സിഡേഷനെ വാർധക്യത്തിന്റെ ഒരു സുപരിചിത സൂചകവുമായി ബന്ധിപ്പിക്കുന്നു. നാനോമോളാർ സാന്ദ്രതയിലുള്ള മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവും SkQ1-ഉം ഓരോന്നും പെറോക്സിഡേഷൻ, കോശമരണം, വർണകത്തിന്റെ അടിഞ്ഞുകൂടൽ എന്നിവ തടഞ്ഞു. വേർതിരിച്ചെടുത്ത ഹൃദയ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയ ഈ ക്രമം സ്ഥിരീകരിച്ചു: റോട്ടനോണും ഫെറസ് ഇരുമ്പും ചേർന്നപ്പോൾ പെറോക്സിഡേഷനും വർണകത്തിന് സമാനമായ സിഗ്നലും ഉണ്ടായി; രണ്ട് പദാർഥങ്ങളും അത് തടഞ്ഞു. പൂർണ ക്രമം H9c2 ഹൃദയപേശി കോശങ്ങളിലെ ഇരുമ്പ് അമിതഭാരത്തെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനത്തിൽ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. വർണകവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഈ ഭാഗം ലിപോഫുസിനും കോശ വാർധക്യ സൂചകങ്ങളും എന്ന വിഷയത്തോടൊപ്പം വായിക്കേണ്ടതാണ്.

കോശങ്ങളുടെ ജീവനിലനിൽപ്പ് പരിശോധനകൾ കാണിക്കാത്തത്

CellTiterBlue പോലുള്ള ജീവക്ഷമതാ പരിശോധന, ഒരു പ്രേരകവും സംരക്ഷണം നൽകാൻ സാധ്യതയുള്ള ഒരു പദാർഥവും നൽകിയശേഷം കൾച്ചർ പാത്രത്തിലെ എത്ര കോശങ്ങൾ ഉപാപചയപരമായി സജീവമായി തുടരുന്നു എന്നാണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. നിർവചിക്കപ്പെട്ട ഒരു സംവിധാനത്തിൽ ഒരു പ്രവർത്തനരീതി പരിശോധിക്കുകയാണ് ഇത്. ഇത് ഒരു ചികിത്സാഫലമല്ല. ഈ പരീക്ഷണങ്ങളിലൊന്നും ഒരു രോഗിക്ക് പദാർഥം നൽകിയിട്ടില്ല, രോഗവുമായി ബന്ധപ്പെട്ട അന്തിമഫലം അളന്നിട്ടില്ല, ശരീരത്തിനുള്ളിൽ ഒരു ചികിത്സാപരമായ സുരക്ഷിത അളവുപരിധി സ്ഥാപിച്ചിട്ടില്ല.

നാല് പരിമിതികൾ വ്യക്തമായി പറയേണ്ടതുണ്ട്. ഒന്നാമതായി, കോശങ്ങളുടെ തരങ്ങൾ പരിമിതമാണ്: രൂപാന്തരപ്പെടുത്തിയ ശ്വാസകോശ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ, ഒരു മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ രോഗ സെൽ ലൈൻ ഉൾപ്പെടെയുള്ള പ്രാഥമിക ചർമ്മ ഫൈബ്രോബ്ലാസ്റ്റുകൾ, ഒരു എലി ഹൃദയപേശി സെൽ ലൈൻ, കൂടാതെ വേർതിരിച്ചെടുത്ത എലി ഹൃദയ മൈറ്റോകോണ്ട്രിയ. സെൽ ലൈനുകൾക്കിടയിൽ സംവേദനക്ഷമത വ്യത്യാസപ്പെട്ടു; പഠനരൂപകൽപ്പനയുടെ ഭാഗമായിത്തന്നെ LHON ലൈൻ അസാധാരണമായി ദുർബലമായിരുന്നു. രണ്ടാമതായി, പ്രേരകങ്ങൾ ലബോറട്ടറിയിലെ അതിരൂക്ഷ സാഹചര്യങ്ങളാണ്: പദാർഥ ഗതാഗതമോ സംശ്ലേഷണമോ പൂർണമായി തടയുന്നതും, ഒരു കലയും പെട്ടെന്നുള്ള സാഹചര്യത്തിൽ നേരിടാത്തത്ര ഉയർന്ന ഇരുമ്പ് അളവുകളും. മൂന്നാമതായി, സാന്ദ്രതയെ ഒരു സംഖ്യകൊണ്ട് ഗുണിച്ച് മനുഷ്യർക്കുള്ള അളവാക്കി മാറ്റാനാവില്ല. കൾച്ചർ മാധ്യമത്തിലെ നാനോമോളാർ സാന്ദ്രത മനുഷ്യർക്കുള്ള ഒരു ഡോസല്ല. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ വിതരണം, രക്തത്തിലും കലകളിലും അതിന്റെ നിറമില്ലാത്ത രൂപത്തിലേക്കുള്ള നിരോക്സീകരണം, വെളിച്ചം ഏൽക്കുന്നത്, സ്തര പൊട്ടൻഷ്യൽ എന്നിവയെല്ലാം കൾച്ചർ പാത്രത്തിലെ ഫലത്തിനും ഒരു വ്യക്തിയിലെ ഫലത്തിനും ഇടയിലുള്ള ഘടകങ്ങളാണ്. നാലാമതായി, പ്രോബുകൾ അവ സ്ഥിതിചെയ്യുന്ന ഉപവിഭാഗത്തെക്കുറിച്ചാണ് സൂചിപ്പിക്കുന്നത്. MitoCLox ഓക്സീകരണം മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ലിപിഡ് റാഡിക്കലുകൾ രൂപപ്പെട്ടുവെന്ന് കാണിക്കുന്നു. എന്നാൽ സാധ്യതയുള്ള അവസാന സംഭവമായ പ്ലാസ്മ സ്തരത്തിന്റെ പൊട്ടൽ നേരിട്ട് തടയപ്പെട്ടോ, അതോ മുൻഘട്ടത്തിലെ ഇടപെടൽ മൂലം ഒഴിവായോ എന്ന് അത് കാണിക്കുന്നില്ല.

അതിനാൽ തെളിവുകളോട് നീതി പുലർത്തുന്ന നിഗമനം ഇതാണ്: ഈ മാതൃകകളിൽ, കോംപ്ലക്സ് I-ൽനിന്നുള്ള ROS-ഉം ഇരുമ്പും ചേർന്ന് ഫെറോപ്റ്റോസിസിനു മുമ്പുള്ള മൈറ്റോകോണ്ട്രിയൽ ലിപിഡ് പെറോക്സിഡേഷനെ നയിക്കുന്നു; കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതകളിലുള്ള മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ആ ഘട്ടത്തെ തടസ്സപ്പെടുത്തുന്നു. ആ ഘട്ടത്തിനപ്പുറമുള്ള ഏതൊരു നിഗമനത്തിനും ആദ്യം മൃഗങ്ങളിലും പിന്നീട് മനുഷ്യരിലും വ്യത്യസ്ത പരീക്ഷണങ്ങൾ ആവശ്യമാണ്.