സാന്ദ്രത മാറുമ്പോൾ മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ ആഗിരണം മാറുന്നത് എന്തുകൊണ്ട്

മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ ഒരു സ്റ്റോക്ക് കുപ്പിയെടുത്ത് രണ്ട് ഗ്ലാസുകളിൽ ഒഴിക്കുക. ആദ്യത്തേതിൽ സ്റ്റോക്ക് ലായനിയും രണ്ടാമത്തേതിൽ പത്തിരട്ടി നേർപ്പിച്ച ലായനിയും നിറയ്ക്കുക. പ്രതീക്ഷിച്ചതുപോലെ രണ്ടാമത്തെ ഗ്ലാസിലെ നിറം മങ്ങിയതാണ്. സൂക്ഷിച്ചുനോക്കുമ്പോൾ മറ്റൊരു മാറ്റവും കാണാം. വർണഭാവം മാറിയിരിക്കുന്നു. ഒരു ലായനി തെളിഞ്ഞ ആകാശനീലത്തിലേക്കും മറ്റൊന്ന് വയലറ്റ് കലർന്ന നീലയിലേക്കും ചായുന്നു. നേർപ്പിക്കൽ തീവ്രത കുറയ്ക്കുക മാത്രമല്ല ചെയ്തത്. ആഗിരണത്തിൽ ഏറ്റവും കൂടുതൽ പങ്കുവഹിക്കുന്ന രാസരൂപം ഏതെന്നതും അത് മാറ്റി.

ഈ മാറ്റത്തിനു പിന്നിലെ ആശയം ലളിതമാണ്. ലയിച്ച മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഒരൊറ്റ രാസരൂപമല്ല. മോണോമർ എന്നു വിളിക്കുന്ന ഒറ്റ വർണക കാറ്റയോണിന് മറ്റൊരു കാറ്റയോണുമായി മുഖാമുഖം അടുക്കി ഒരു ഡൈമർ രൂപപ്പെടാം. ഡൈമറുകൾക്ക് കൂടുതൽ വലിയ അഗ്രിഗേറ്റുകളായി വളരാനും കഴിയും. ഓരോ രൂപത്തിനും അതിന്റേതായ ആഗിരണ സ്പെക്ട്രമുണ്ട്. ആ സാഹചര്യങ്ങളിൽ ആ ക്യൂവെറ്റിലുള്ള മിശ്രിതത്തിലെ എല്ലാ രൂപങ്ങളുടെയും ആഗിരണത്തിന്റെ ആകെ ഫലമാണ് സ്പെക്ട്രോഫോട്ടോമീറ്റർ റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നത്. ആകെ വർണകത്തിന്റെ അളവ് നേർപ്പിക്കൽ അനുപാതത്തിന് നേരിട്ട് ആനുപാതികമായി മാറിയാലും, മിശ്രിതത്തിന്റെ ഘടന മാറുമ്പോൾ സ്പെക്ട്രവും മാറുന്നു.

മോണോമറും ഡൈമറും വ്യത്യസ്തമായി ആഗിരണം ചെയ്യുന്നു

വലയഘടനയിലുടനീളം പോസിറ്റീവ് ചാർജ് വ്യാപിച്ചിരിക്കുന്ന ഒരു പരന്ന കാർഡായി മോണോമറിനെ സങ്കൽപ്പിക്കുക. അത്തരം രണ്ട് കാർഡുകൾക്ക് മുഖാമുഖം അടുക്കാൻ കഴിയും. പോസിറ്റീവ് ചാർജുകൾ പരസ്പരം വികർഷിക്കുമെങ്കിലും, പരന്ന അരോമാറ്റിക് പ്രതലങ്ങൾ അടുക്കലുമായി ബന്ധപ്പെട്ട പരസ്പരപ്രവർത്തനങ്ങളിലൂടെ ആകർഷിക്കുന്നു. ചുറ്റുമുള്ള വെള്ളവും പ്രതിവിരുദ്ധ അയോണുകളും വികർഷണത്തെ മറയ്ക്കുന്നു. ഇതിന്റെ ഫലമായി, ഇലക്ട്രോണിക് അവസ്ഥകൾ പങ്കിടുന്ന ഒരു ബന്ധിത ജോഡി രൂപപ്പെടുന്നു. അതിന്റെ അനുവദനീയമായ സംക്രമണങ്ങൾ മോണോമറിന്റെ സംക്രമണത്തേക്കാൾ ഉയർന്ന ഊർജനിലയിലാണ്. അതിനാൽ ഡൈമർ ബാൻഡ് മോണോമർ ബാൻഡിനേക്കാൾ കുറഞ്ഞ തരംഗദൈർഘ്യത്തിൽ പ്രത്യക്ഷപ്പെടുന്നു. കൂടുതൽ വലിയ അഗ്രിഗേറ്റുകൾ നീല ഭാഗത്തേക്ക് കൂടുതൽ സംഭാവന നൽകുന്നത് ഒരു ഷോൾഡർ രൂപത്തിലാണ്.

ശുദ്ധജലത്തിൽ വളരെ കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയിൽ മോണോമറുകൾക്ക് മേൽക്കൈയുണ്ട്; ദീർഘ തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള ബാൻഡും പ്രബലമാണ്. ആകെ സാന്ദ്രത ഉയരുമ്പോൾ ജോഡിയായ രൂപത്തിന്റെ പങ്ക് വർധിക്കുകയും ആദ്യത്തെ ബാൻഡിനെ അപേക്ഷിച്ച് കുറഞ്ഞ തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള ബാൻഡ് വളരുകയും ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ രണ്ട് ബാൻഡുകളുടെ അനുപാതം സൂചിപ്പിക്കുന്നത് മിശ്രിതത്തിന്റെ ഘടനയാണ്, ആകെ സാന്ദ്രത നേരിട്ടല്ല. ഏത് രൂപമാണ് ഉള്ളതെന്ന ഒരു അനുമാനമില്ലാതെ, ഒറ്റ തരംഗദൈർഘ്യത്തിലെ അളവിലൂടെ ഇവ രണ്ടിനെയും വേർതിരിക്കാനാവില്ല.

അതുകൊണ്ടാണ് റഫറൻസ് സ്പെക്ട്രങ്ങൾക്കൊപ്പം അവ ലഭിച്ച സാഹചര്യങ്ങളും എപ്പോഴും നൽകേണ്ടത്. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ സ്പെക്ട്രൽ റഫറൻസ് ബാൻഡുകളുടെ സ്ഥാനങ്ങൾക്കൊപ്പം അവ ലഭിച്ച ലായകം, പശ്ചാത്തല ലവണഘടന, pH, താപനില, സാന്ദ്രതാപരിധി എന്നിവയും പട്ടികപ്പെടുത്തുന്നു. ആ സാഹചര്യങ്ങളില്ലാതെ ഒരു പീക്കിന്റെ സ്ഥാനം ഉദ്ധരിച്ചാൽ ആ സംഖ്യയ്ക്ക് ആവശ്യമായ വിശദാംശങ്ങൾ അപൂർണമാണ്. ഒരേ വർണകത്തിൽനിന്നുള്ള വ്യത്യസ്ത സ്പെക്ട്രങ്ങളെക്കുറിച്ച് രണ്ട് ലബോറട്ടറികളും ശരിയായിരിക്കാം; കാരണം അവ അളന്നത് വ്യത്യസ്ത മിശ്രിതങ്ങളെയാണ്.

സന്തുലനത്തെ മാറ്റുന്ന ഘടകങ്ങൾ

സാന്ദ്രതയാണ് പ്രധാന നിയന്ത്രണഘടകം. ഡൈമർ രൂപപ്പെടാൻ രണ്ട് മോണോമറുകൾ കൂടിച്ചേരണം. അതിനാൽ ആകെ വർണകത്തിന്റെ അളവിനോടുള്ള രേഖീയ വർധനയെക്കാൾ വേഗത്തിൽ ഡൈമറിന്റെ പങ്ക് ഉയരുന്നു. മുറിയിലെ താപനിലയ്ക്കടുത്ത് ജലീയ ഡൈമറീകരണ സ്ഥിരാങ്കങ്ങൾ ആയിരക്കണക്കിന് per molar എന്ന നിരക്കിലാണെന്ന് റിപ്പോർട്ട് ചെയ്തിട്ടുണ്ട്. അതിനാൽ micromolar പരിധിയിൽ ഡൈമറിന്റെ പങ്ക് കുത്തനെ ഉയരുന്നു. micromolar മുതൽ millimolar വരെ വർണക സാന്ദ്രതകൾ ഉൾപ്പെടുത്തിയ വിശാലമായ ഒരു ഗ്ലോബൽ ഫിറ്റിൽ, 34 micromolar-ൽ താഴെ തന്നെ ടെട്രാമറിന്റെ സംഭാവന പൂജ്യമല്ലെന്ന് കണ്ടെത്തി. അതിനാൽ പത്തുകളുടെ micromolar പരിധിയിൽ കർശനമായ രണ്ടുരൂപ ഫിറ്റിനെ ആശ്രയിക്കുന്നതിൽ ജാഗ്രത വേണം. കൃത്യമായ അംശങ്ങൾ മാധ്യമത്തെ ആശ്രയിച്ചിരിക്കുന്നു. അതുകൊണ്ടാണ് ഈ ലേഖനം സാർവത്രിക പരിവർത്തനപ്പട്ടികയ്ക്കുപകരം മാറ്റങ്ങളുടെ ദിശകൾ നൽകുന്നത്.

ലവണമാണ് രണ്ടാമത്തെ നിയന്ത്രണഘടകം. ലയിച്ച അയോണുകൾ രണ്ട് കാറ്റയോണുകൾക്കിടയിലെ വികർഷണത്തെ മറയ്ക്കുന്നു. അതിനാൽ സോഡിയം ക്ലോറൈഡും സമാന ഇലക്ട്രോലൈറ്റുകളും ചേർക്കുമ്പോൾ, ഒരേ വർണക സാന്ദ്രതയിൽ മിശ്രിതം ഡൈമറുകളിലേക്കും അഗ്രിഗേറ്റുകളിലേക്കും നീങ്ങുന്നു. ലവണജലത്തിലും ജലീയ മാധ്യമങ്ങളിലും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂവിന്റെ കൂട്ടുചേരലിനെക്കുറിച്ചുള്ള പഠനങ്ങളിൽ ഈ ഫലം കാണാം. അവയിൽ ഏകദേശം 1 micromolar മുതൽ 3.4 millimolar വരെ വർണകം, 0 മുതൽ 0.15 molar വരെ സോഡിയം ക്ലോറൈഡ് ഉള്ള സാഹചര്യങ്ങളിൽ അളന്നു. ആ ഫിറ്റിൽ വർണകവും ലവണവും ഏറ്റവും കൂടുതലുള്ള സാഹചര്യത്തിൽ ടെട്രാമർ അംശം ഏകദേശം 0.93 ആയി. അതിനാൽ വെള്ളത്തിൽ രേഖപ്പെടുത്തിയ സ്പെക്ട്രവും ഫിസിയോളജിക്കൽ സലൈനിൽ രേഖപ്പെടുത്തിയ സ്പെക്ട്രവും പരസ്പരം പകരം ഉപയോഗിക്കാവുന്ന മാനദണ്ഡങ്ങളല്ല.

താപനില വിപരീതദിശയിലാണ് പ്രവർത്തിക്കുന്നത്. അടുക്കൽ ബന്ധിത ജലത്തെ സ്വതന്ത്രമാക്കുന്നു; താപചലനം അടുക്കലിനെ എതിർക്കുന്നു. അതിനാൽ ലായനി ചൂടാക്കുമ്പോൾ സാധാരണയായി ചില ഡൈമറുകൾ വിഘടിച്ച് മോണോമറുകളാകുന്നു; തണുപ്പിക്കൽ കൂടിച്ചേരലിനെ അനുകൂലിക്കുന്നു. ഫിറ്റിലൂടെ ലഭിച്ച വിഘടന എൻതാൽപി നെഗറ്റീവാണ്: 282 മുതൽ 333 kelvin വരെയുള്ള പരിധിയിൽ ഏകദേശം മൈനസ് 30 kilojoules per mole. ഇത് താപം പുറത്തുവിടുന്ന കൂടിച്ചേരലിനെ സ്ഥിരീകരിക്കുന്നു. ശീതീകരണത്തിനു തൊട്ടുപിന്നാലെ അളക്കുന്ന തണുത്ത സാമ്പിൾ, മുറിയിലെ താപനിലയുമായി സന്തുലനത്തിലെത്തിയശേഷം അളക്കുന്ന അതേ സാമ്പിളിനെക്കാൾ കൂടുതൽ കൂട്ടുചേർന്നതായി തോന്നാം.

ലായകമാണ് അടിസ്ഥാന സാഹചര്യം നിർണയിക്കുന്നത്. ശക്തമായ ഹൈഡ്രോഫോബിക് പ്രഭാവമുള്ള വെള്ളം പരന്ന വർണക കാറ്റയോണുകൾ അടുക്കുന്നതിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കുന്നു. എഥനോൾ, മെഥനോൾ തുടങ്ങിയ ആൽക്കഹോളുകൾ വലയങ്ങളെ കൂടുതൽ നന്നായി സോൾവേറ്റ് ചെയ്യുകയും അഗ്രിഗേറ്റുകളെ വേർപെടുത്തുകയും ചെയ്യുന്നു. അതിനാൽ ഒരേ വർണക സാന്ദ്രതയിൽ വെള്ളത്തിലേതിനെക്കാൾ എഥനോളിൽ മോണോമർ സ്വഭാവം കൂടുതലായി കാണപ്പെടുന്നു. അപ്രോട്ടിക് സഹലായകങ്ങളും ഇതുതന്നെ ചെയ്യുന്നു: 293 kelvin-ൽ വെള്ളവും DMSO-യും ചേർന്ന മിശ്രിതങ്ങളിൽ, DMSO ചേർത്തത് ഡൈമറീകരണം കുറച്ചു. ഇത് അടുക്കലിനെ നയിക്കുന്നതിൽ ജലഘടനയ്ക്ക് പങ്കുണ്ടെന്ന് സൂചിപ്പിക്കുന്നു. സർഫാക്റ്റന്റുകളുടെ കാര്യത്തിൽ ഇരുദിശയിലും ശ്രദ്ധ വേണം. അവയുടെ നിർണായക മൈസെൽ സാന്ദ്രതയ്ക്കു മുകളിൽ, മൈസെലുകൾക്ക് മോണോമറുകളെ ഒറ്റയ്ക്കൊറ്റയ്ക്ക് ലയിപ്പിച്ച് മോണോമറിനു സമാനമായ സ്പെക്ട്രം പുനഃസ്ഥാപിക്കാം. ആ പരിധിക്കു താഴെ, വിപരീത ചാർജുള്ള സർഫാക്റ്റന്റിന് അടുക്കലിനെ പ്രോത്സാഹിപ്പിക്കാം: 100 micromolar വർണകത്തിൽ, SDS നയിച്ച പോളിമറീകരണം ഏകദേശം 4 millimolar SDS-ൽ പരമാവധിയിലെത്തി. ഇത് മൈസെൽ രൂപീകരണ പരിധിയുടെ ഏകദേശം പകുതിയാണ്; ഉയർന്ന സർഫാക്റ്റന്റ് അളവുകളിൽ പിന്നീട് പുനർവിതരണം നടന്നു. വർണക-ലായക ഇടപെടലുകളും സംഘടിത മാധ്യമങ്ങളും മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ സ്പെക്ട്രങ്ങളിൽ ചെലുത്തുന്ന സ്വാധീനത്തെക്കുറിച്ചുള്ള ഗവേഷണം കാണുന്നത്, ആകെ സാന്ദ്രത മാത്രമല്ല, തന്മാത്രയുടെ തൊട്ടടുത്ത പരിസരവും നിരീക്ഷിക്കുന്ന ബാൻഡുകളെ ശക്തമായി നിർണയിക്കുന്നു എന്നാണ്.

pH പ്രധാനമായും അങ്ങേയറ്റങ്ങളിലാണ് പ്രസക്തമാകുന്നത്. മിക്ക ലബോറട്ടറി പ്രവർത്തനങ്ങളിലും ഉപയോഗിക്കുന്ന ന്യൂട്രലിനടുത്ത പരിധിയിൽ, മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ അതിന്റെ പരിചിതമായ നീല കാറ്റയോണിക് രൂപത്തിൽ തുടരുന്നു. സ്പെക്ട്രത്തിലെ മാറ്റങ്ങളിൽ കൂട്ടുചേരലാണ് പ്രധാന പങ്കുവഹിക്കുന്നത്. ശക്തമായ ആസിഡോ ബേസോ, നിറമില്ലാത്ത ല്യൂക്കോ രൂപം ഉൽപ്പാദിപ്പിക്കുന്ന റെഡോക്സ് രസതന്ത്രം, പ്രോട്ടീനുകളുമായോ കണികകളുമായോ ഉള്ള ബന്ധനം എന്നിവ ഓരോന്നും മോണോമർ-ഡൈമർ ജോഡിക്കപ്പുറമുള്ള അവസ്ഥകൾ ചേർക്കുന്നു. ഒരു ബഫർ ചേർത്തശേഷം സ്പെക്ട്രം മാറിയാൽ, എല്ലാം pH-നു മാത്രം ചുമത്തുന്നതിനുമുമ്പ് ബഫറിലെ ലവണങ്ങളും ബന്ധനത്തിൽ പങ്കാളികളാകുന്ന ഘടകങ്ങളും പരിശോധിക്കുക. രസതന്ത്രവും പ്രോട്ടോണേഷനും സംബന്ധിച്ച റഫറൻസ്, രാസരൂപം തിരിച്ചറിയുന്നതുമായി ബന്ധപ്പെട്ട ഈ ചോദ്യങ്ങളെ ഇവിടെ ചർച്ച ചെയ്യുന്ന കൂട്ടുചേരൽ എന്ന വിഷയത്തിൽനിന്ന് വേർതിരിച്ചു കൈകാര്യം ചെയ്യുന്നു.

ബിയർ-ലാംബർട്ട് നേർരേഖ വളയുന്നത് എന്തുകൊണ്ട്

ആഗിരണാങ്കം എന്നത് ആഗിരണക്ഷമത, സാന്ദ്രത, പ്രകാശപാതയുടെ നീളം എന്നിവയുടെ ഗുണനഫലമാണെന്ന് ബിയർ-ലാംബർട്ട് ബന്ധം പറയുന്നു. ഇത് എണ്ണത്തെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള ഒരു നിയമമാണ്. എണ്ണപ്പെടുന്ന വസ്തുക്കളുടെ എണ്ണം മാറുമ്പോഴും അവയുടെ സ്വഭാവം ഒരേപോലെ തുടരുമെന്ന് ഇത് അനുമാനിക്കുന്നു: ഒരൊറ്റ ആഗിരണരൂപം, മാറ്റമില്ലാത്ത സ്പെക്ട്രം, സാന്ദ്രതയ്ക്കനുസരിച്ചുള്ള രാസമാറ്റങ്ങളില്ലായ്മ, പരിശോധനയ്ക്കായി ഏകവർണ പ്രകാശം, പ്രകീർണനമോ പുനഃഉത്സർജനമോ ഇല്ലായ്മ, പ്രസ്താവിച്ച പ്രകാശപാതയിലൂടെ യഥാർഥത്തിൽ സഞ്ചരിക്കുന്ന പ്രകാശം.

കൂട്ടുചേരൽ ആദ്യത്തെ അനുമാനത്തെ ലംഘിക്കുന്നു. ഔപചാരികമായി, ആകെ ആഗിരണാങ്കം ഓരോ രാസരൂപത്തിന്റെയും സംഭാവനകളുടെ തുകയായി തുടരുന്നു: പ്രകാശപാതയുടെ നീളം, ഓരോ രൂപത്തിന്റെയും ആഗിരണക്ഷമത, അതത് രൂപത്തിന്റെ സാന്ദ്രത എന്നിവയുടെ ഗുണനഫലങ്ങളുടെ തുക. ഓരോ രൂപവും നിയമം അനുസരിക്കുന്നു. എന്നാൽ മിശ്രിതം അനുസരിക്കുന്നില്ല; കാരണം ഓരോ രൂപത്തിന്റെയും സാന്ദ്രത ആകെ വർണകത്തിന്റെ അളവിന്റെ അരേഖീയ ഫലനമാണ്. അതിനാൽ ആകെ വർണകത്തിന്റെ അളവിനെതിരെ മോണോമർ ബാൻഡിലെ ആഗിരണാങ്കം രേഖപ്പെടുത്തുന്ന കാലിബ്രേഷൻ വക്രം നേർപ്പിച്ച പരിധിയിൽ നേർരേഖയായി തുടങ്ങുകയും സാന്ദ്രത ഉയരുമ്പോൾ താഴേക്ക് വളയുകയും ചെയ്യുന്നു. കാരണം ഓരോ അധിക വർധനവിലും ആനുപാതികമായി കുറവ് മോണോമറാണ് ലഭിക്കുന്നത്. ഡൈമർ ബാൻഡിൽ അളക്കുന്ന വക്രം വിപരീതദിശയിൽ വളയുന്നു. നിരീക്ഷിച്ച ലാംബർട്ട്-ബിയർ വ്യതിയാനങ്ങളുടെ കാരണമായി കൂട്ടുചേരലിനെക്കുറിച്ചുള്ള ഗവേഷണം ചൂണ്ടിക്കാട്ടുന്നത് കൃത്യമായി ഈ സംവിധാനമാണ്. വളഞ്ഞ പ്രദേശത്തിലൂടെ ഒരു നേർരേഖ ഫിറ്റ് ചെയ്ത് അതിനെ പരിധിക്കപ്പുറത്തേക്ക് നീട്ടുന്നതാണ് പതിവായി സംഭവിക്കുന്ന പിശക്. ആ രേഖ സൃഷ്ടിച്ച പരിധിയിലും മാട്രിക്സിലും മാത്രമേ സാധുവാകൂ.

നേർപ്പിക്കൽ ഇതുമായി ബന്ധപ്പെട്ട മറ്റൊരു കെണി സൃഷ്ടിക്കുന്നു. സാന്ദ്രമായ സ്റ്റോക്ക് ലായനിയെ ഉപകരണത്തിന്റെ അളക്കൽപരിധിയിലേക്ക് കൊണ്ടുവരാൻ നേർപ്പിക്കുമ്പോൾ രാസരൂപങ്ങളുടെ അനുപാതം നിലനിൽക്കില്ല. നേർപ്പിച്ച ക്യൂവെറ്റിലെ ലായനി മോണോമറിലേക്കു ചായുന്ന പുതിയ സന്തുലനത്തിലെത്തുന്നു. അതിനാൽ അതിന്റെ സ്പെക്ട്രം നേർപ്പിച്ച സാമ്പിളിനെ ശരിയായി വിവരിക്കുമെങ്കിലും സ്റ്റോക്കിനെ തെറ്റായാണ് വിവരിക്കുന്നത്. ആഗിരണാങ്കങ്ങൾ അനുപാതികമായി വർധിപ്പിച്ച് സ്റ്റോക്ക് സ്പെക്ട്രം തിരിച്ചുകണക്കാക്കുന്നത്, കാലിബ്രേഷൻ ഇതിനകം ഈ മാറ്റം കണക്കിലെടുത്തിട്ടുണ്ടെങ്കിൽ മാത്രമേ ആകെ ഉള്ളടക്കത്തിന്റെ കണക്ക് വീണ്ടെടുക്കൂ. അത് ഒരിക്കലും യഥാർഥ ബാൻഡ് ആകൃതി പുനഃസ്ഥാപിക്കുന്നില്ല. സാന്ദ്രലായനിയുടെ സ്പെക്ട്രത്തെ നേർപ്പിച്ച റഫറൻസുമായി താരതമ്യം ചെയ്യുന്ന ആരും താരതമ്യം ചെയ്യുന്നത് രണ്ട് വ്യത്യസ്ത മിശ്രിതങ്ങളെയാണ്.

പ്രകാശപാതയുടെ നീളം ഫലത്തിന്റെ ഭാഗമാണ്

സാമ്പിളിലൂടെ പ്രകാശം സഞ്ചരിക്കുന്ന ദൂരത്തിന് ആനുപാതികമായി ആഗിരണാങ്കം മാറുന്നു. ഒരേ ലായനി നിറച്ച 1 mm ക്യൂവെറ്റിനെക്കാൾ പത്തിരട്ടി ആഗിരണാങ്കം 10 mm ക്യൂവെറ്റ് നൽകുന്നു. ഒരേ ലായനിക്കു മാത്രമാണ് ഈ അനുപാതം കൃത്യമായി ബാധകമാകുന്നത്. കൂട്ടുചേരൽ ആ നിബന്ധനയെ നിർണായകമാക്കുന്നു.

പ്രായോഗികമായി, സാധുവായ പരിധിക്കുള്ളിൽ തുടരാനുള്ള ഒരു ഉപാധിയാണ് പ്രകാശപാതയുടെ നീളം. നീണ്ട പാത നേർപ്പിച്ചതും കൂടുതലും മോണോമറുകളുള്ളതുമായ ലായനികൾക്ക് സംവേദനക്ഷമത നൽകുന്നു. സന്തുലനം മാറ്റുന്ന വലിയ നേർപ്പിക്കൽ നടത്താതെ സാന്ദ്രമായ സാമ്പിളിനെ അളക്കൽപരിധിക്കുള്ളിൽ നിലനിർത്താൻ ചെറിയ പാത സഹായിക്കുന്നു. മുകളിലെ സംഖ്യകൾക്ക് അടിസ്ഥാനമായ കൂട്ടുചേരൽ ഗവേഷണത്തിൽ കൃത്യമായി ഇതാണ് ചെയ്തത്: 1.1 മുതൽ 34 micromolar വരെ വർണകത്തിന് 1 centimeter സെല്ലുകളും, 94 micromolar മുതൽ 3.4 millimolar വരെ വർണകത്തിന് 0.01 centimeter സെല്ലുകളും ഉപയോഗിച്ചു. മൈക്രോവോള്യം പെഡസ്റ്റലുകളും പ്ലേറ്റ് റീഡറുകളും അവയുടേതായ ജ്യാമിതിയും ചേർക്കുന്നു: ചെറുതും ചിലപ്പോൾ മാറുന്നതുമായ പ്രകാശപാതകളും കാറ്റയോണിക് വർണകം അധിശോഷിക്കാവുന്ന പ്രതലങ്ങളും. സ്പെക്ട്രൽ റഫറൻസ് ലായകവും ലവണവും റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുന്നതുപോലെ, അളവിനൊപ്പം പ്രകാശപാതയുടെ നീളവും റിപ്പോർട്ട് ചെയ്യുക. പ്രകാശപാതയുടെ നീളമില്ലാത്ത ആഗിരണാങ്കം ഒരു ഫലമല്ല. അത് ഒരു അഭ്യൂഹമാണ്.

ഈ സംവിധാനത്തിൽനിന്നാണ് അളക്കലിലെ ചിട്ട രൂപപ്പെടുന്നത്. അളക്കുന്നതിനുമുമ്പ് സാമ്പിളുകളെ ഒരേ താപനിലയിൽ സന്തുലനത്തിലെത്തിക്കുക. ഒരേ ക്യൂവെറ്റ് തരവും ദിശാവിന്യാസവും, ഒരേ ലവണ-ബഫർ പശ്ചാത്തലമുള്ള അനുയോജ്യമായ ബ്ലാങ്കുകളും, വൃത്തിയുള്ള ഗ്ലാസ് ഉപകരണങ്ങളും ഉപയോഗിക്കുക. മെത്തിലീൻ ബ്ലൂ ഗ്ലാസിന്റെയും പ്ലാസ്റ്റിക്കിന്റെയും ഉപരിതലത്തിൽ അധിശോഷിക്കപ്പെടുന്നതിനാൽ, കറപിടിച്ച ക്യൂവെറ്റിൽ മുമ്പത്തെ സാന്ദ്ര സാമ്പിളിന്റെ അവശിഷ്ടസ്വാധീനം നിലനിൽക്കും. കൂട്ടുചേരലിന്റെ ഗതികം പ്രധാനമാകുമ്പോൾ തയ്യാറാക്കിയ ഉടൻ അളക്കുക. ഓരോ കാലിബ്രേഷൻ വക്രവും സാന്ദ്രത അറിയാത്ത സാമ്പിളുകളുടെ അതേ മാട്രിക്സിലും അതേ പ്രകാശപാത നീളത്തിലും നിർമ്മിക്കുക. കാഴ്ചയെ അടിസ്ഥാനമാക്കിയുള്ള പരിശോധനകളിൽ കണ്ണ് ഒരു നല്ല സ്പെക്ട്രോമീറ്ററല്ലെന്ന് ഓർക്കുക. ലായനിയുടെ നിറത്തിന് ശുദ്ധത സ്ഥിരീകരിക്കാനാകുമോ എന്നത് വേറൊരു ചോദ്യമാണ്; ഉത്തരം ഇല്ല എന്നാണ്. കൂട്ടുചേരൽ മൂലമുള്ള വർണഭാവമാറ്റങ്ങൾ അതിന്റെ ഒരു കാരണമാണ്.

ഉപകരണത്തിനരികിൽ സൂക്ഷിക്കാനുള്ള ഒരു ചിത്രം

താഴെയുള്ള ചിത്രം ഈ ലേഖനത്തെ ലബോറട്ടറി ബെഞ്ചിനുള്ള ഒരു റഫറൻസായി ചുരുക്കുന്നു. മൂന്ന് ലായനികളിലും ഒരേ വർണകമാണുള്ളത്; എന്നാൽ ആകെ സാന്ദ്രതയും പശ്ചാത്തല ലവണഘടനയും വ്യത്യസ്തമാണ്. അടുക്കൽ വർധിക്കുമ്പോൾ ദീർഘ തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള മോണോമർ ബാൻഡിന്റെ പങ്ക് കുറഞ്ഞ തരംഗദൈർഘ്യമുള്ള ഡൈമർ ബാൻഡിലേക്കു മാറുന്നത് അവയുടെ സൂചനാത്മക സ്പെക്ട്രങ്ങൾ കാണിക്കുന്നു. സാഹചര്യങ്ങളില്ലാതെ ഈ വക്രങ്ങൾ വീണ്ടും ഉപയോഗിക്കാനാവാത്തതിനാൽ അവ ചിത്രത്തിൽ അച്ചടിച്ചിട്ടുണ്ട്. നിർദിഷ്ട സാഹചര്യങ്ങളിൽ അളന്ന ബാൻഡ് സ്ഥാനങ്ങൾക്ക് സ്പെക്ട്രൽ റഫറൻസ് ഉപയോഗിക്കുക. വർണകം ലായനിയിലായിക്കഴിഞ്ഞാൽ കോശങ്ങളിലേക്ക് എങ്ങനെ പ്രവേശിക്കുന്നു എന്നറിയാൻ റിഡക്ഷനിലൂടെയും പാർട്ടിഷനിങ്ങിലൂടെയും കോശപ്രവേശനം കാണുക. പ്രകാശ ഡോസും ജ്യാമിതിയും പ്രകാശരാസ അളവുകളെ കൂടുതൽ എങ്ങനെ രൂപപ്പെടുത്തുന്നു എന്നറിയാൻ പ്രകാശസമ്പർക്കവും അളക്കലിന്റെ ജ്യാമിതിയും കാണുക.

ഓർത്തിരിക്കേണ്ട നിയമത്തിന് രണ്ട് ഭാഗങ്ങളുണ്ട്. നിർദിഷ്ട സാഹചര്യങ്ങളിൽ ക്യൂവെറ്റിലുള്ള മിശ്രിതത്തെ സ്പെക്ട്രം തിരിച്ചറിയുന്നു. അതേ സാഹചര്യങ്ങളിൽ നിർമ്മിച്ച കാലിബ്രേഷനു മാത്രമേ ആഗിരണാങ്കത്തെ ആകെ സാന്ദ്രതയാക്കി മാറ്റാനാകൂ.