Зошто апсорпцијата на метиленското сино се менува со концентрацијата

Земете едно шише со основен раствор на метиленско сино и наполнете две чаши. Првата наполнете ја со основниот раствор, а втората со десеткратно разреден раствор. Втората чаша е побледа, како што се очекува. Погледнете внимателно и ќе забележите дека се сменило уште нешто. Нијансата се поместила. Едниот раствор има повеќе јасна небесносина боја, а другиот сина со виолетова нијанса. Разредувањето направило повеќе од намалување на интензитетот. Ја сменило хемиската форма што најмногу придонесува за апсорпцијата.

Идејата зад ова поместување е едноставна. Раствореното метиленско сино не е само една хемиска форма. Поединечниот катјон на бојата, наречен мономер, може да се нареди лице в лице со втор катјон и да формира димер, а димерите можат да прераснат во поголеми агрегати. Секоја форма има сопствен апсорпциски спектар. Спектрофотометарот го прикажува збирот на придонесите од смесата присутна во таа кивета, под тие услови. Сменете ја смесата и спектарот ќе се помести, дури и кога вкупната содржина на бојата го следи точниот сооднос на разредување.

Мономерот и димерот апсорбираат различно

Замислете го мономерот како рамна картичка со позитивен полнеж распределен низ нејзиниот прстенест систем. Две такви картички можат да лежат лице в лице. Позитивните полнежи се одбиваат, но рамните ароматични површини се привлекуваат преку интеракции на слоевито редење, а околната вода и контрајоните го екранираат одбивањето. Резултатот е врзан пар со заеднички електронски состојби. Неговите дозволени премини се на повисока енергија од преминот на мономерот, па лентата на димерот се појавува на пократка бранова должина од лентата на мономерот, додека поголемите агрегати придонесуваат со рамо уште подалеку кон сината страна.

При многу ниска концентрација во чиста вода доминираат мономерите, а доминира и лентата на подолга бранова должина. Со зголемувањето на вкупната концентрација, спарената форма зазема сè поголем удел, а лентата на пократка бранова должина расте во однос на првата. Затоа соодносот на двете ленти го покажува составот на смесата, а не директно вкупната концентрација. Мерење на една бранова должина не може да ги раздвои двете без претпоставка за тоа која форма е присутна.

Затоа референтните спектри секогаш мора да бидат придружени со условите. Спектралниот референтен преглед за метиленско сино табеларно ги прикажува положбите на лентите заедно со растворувачот, солениот состав на средината, pH, температурата и опсегот на концентрации при кои се добиени. Ако наведете максимум без тие услови, бројката не е доволно определена. Две лаборатории можат да бидат во право за различни спектри на истата боја, бидејќи мереле различни смеси.

Што ја поместува рамнотежата

Концентрацијата е главниот фактор. За да се формира димер, треба да се сретнат два мономера, па неговиот удел расте побрзо од линеарно со вкупната концентрација на бојата. Пријавените константи на димеризација во вода се од редот на илјадници по молар во близина на собна температура, па уделот на димерот нагло расте низ микромоларниот опсег. Едно широко глобално вклопување на моделот во податоци, кое опфаќало микромоларни до милимоларни концентрации на бојата, утврдило ненулти придонес на тетрамерот веќе под 34 микромоларни, што предупредува дека не треба слепо да се верува на строг модел со две хемиски форми при десетици микромоларни. Точните удели зависат од средината, поради што оваа статија ги дава насоките на промена, а не универзална табела за претворање.

Солта е вториот фактор. Растворените јони го екранираат одбивањето меѓу два катјона, па додавањето натриум хлорид и слични електролити ја поместува смесата кон димери и агрегати при иста концентрација на бојата. Овој ефект се гледа во истражувањата за агрегацијата на метиленско сино во солени и водни средини, каде што бојата, од околу 1 микромоларна до 3.4 милимоларни, била мерена при концентрации на натриум хлорид од 0 до 0.15 моларни. Во тој модел, уделот на тетрамерот достигнал околу 0.93 во подрачјето со висока концентрација и на бојата и на солта. Затоа спектар снимен во вода и спектар снимен во физиолошки раствор не се меѓусебно заменливи стандарди.

Температурата дејствува во спротивна насока. Слоевитото редење ослободува врзана вода, а термичкото движење му се спротивставува, па загревањето на растворот обично разложува дел од димерите назад во мономери, додека ладењето ја поттикнува асоцијацијата. Енталпијата на дисоцијација добиена со вклопување на моделот е негативна, околу минус 30 килоџули по мол во опсегот од 282 до 333 келвини, што ја потврдува егзотермната асоцијација. Ладен примерок измерен веднаш по вадење од фрижидер може да изгледа поагрегиран од истиот примерок измерен откако ќе се изедначи со собната температура.

Растворувачот ја поставува основата. Водата, со својот силен хидрофобен ефект, го поттикнува слоевитото редење на рамните катјони на бојата. Алкохолите, како етанол и метанол, подобро ги солватираат прстените и ги разбиваат агрегатите, па при иста концентрација на бојата растворот во етанол изгледа помономерен отколку во вода. Апротичните корастворувачи го прават истото: во смеси од вода и DMSO на 293 келвини, додадениот DMSO ја потиснал димеризацијата, што укажува дека структурата на водата е двигател на слоевитото редење. Кај површински активните материи е потребна претпазливост во двете насоки. Над нивната критична мицеларна концентрација, мицелите можат поединечно да ги солубилизираат мономерите и да вратат спектар сличен на мономерниот. Под таа точка, површински активна материја со спротивен полнеж може наместо тоа да го поттикне слоевитото редење: при 100 микромоларна концентрација на бојата, полимеризацијата поттикната од SDS достигнала максимум близу 4 милимоларни SDS, приближно половина од концентрацијата на формирање мицели, пред да настапи прераспределба при повисоки концентрации на површински активната материја. Истражувањата за ефектите на растворувачот и организираните средини врз спектрите на метиленското сино покажуваат колку силно непосредната молекуларна околина, а не само вкупната концентрација, ги определува набљудуваните ленти.

pH е важна главно во крајните подрачја. Во приближно неутралниот опсег што се користи во најголем дел од лабораториската работа, метиленското сино останува во својата позната сина катјонска форма, а агрегацијата е главниот фактор во спектралните промени. Силна киселина или база, редокс-хемија што ја создава безбојната леуко-форма или врзување за протеини и честички додаваат состојби надвор од парот мономер–димер. Кога спектарот се менува по додавање пуфер, проверете го составот на пуферот за соли и компоненти што можат да се врзуваат, пред сè да ѝ припишете само на pH. Референтниот преглед за хемијата и протонирањето ги разгледува овие прашања за хемискиот идентитет одделно од прашањето за агрегацијата обработено овде.

Зошто правата линија на Бер–Ламберт се закривува

Релацијата на Бер–Ламберт вели дека апсорбанцата е еднаква на апсорптивноста помножена со концентрацијата и со должината на оптичкиот пат. Тоа е закон за броење. Тој претпоставува дека објектите што се бројат остануваат исти додека нивниот број се менува: една апсорбирачка хемиска форма, непроменлив спектар, без хемиски промени со концентрацијата, монохроматска мерна светлина, без расејување или повторна емисија и светлина што навистина го минува наведениот пат.

Агрегацијата ја нарушува првата претпоставка. Формално, вкупната апсорбанца останува збир на придонесите од сите хемиски форми: должината на патот помножена со секоја апсорптивност и со концентрацијата на соодветната форма. Секоја форма го следи законот. Смесата не го следи, бидејќи концентрациите на формите се нелинеарни функции од вкупната концентрација на бојата. Затоа калибрациската крива на апсорбанцата кај мономерната лента во однос на вкупната концентрација на бојата почнува како права во границата на разредени раствори и се закривува надолу со растот на концентрацијата, бидејќи секое дополнително количество носи пропорционално помалку мономер. Крива измерена кај димерната лента се закривува во спротивната насока. Истражувањата за агрегација го посочуваат токму овој механизам како извор на набљудуваните отстапувања од законот на Ламберт–Бер. Вклопувањето права линија низ закривеното подрачје и нејзиното екстраполирање е вообичаената грешка. Правата важи само во опсегот и матрицата во кои е добиена.

Разредувањето создава сродна замка. Разредувањето на концентриран основен раствор за да се влезе во мерниот опсег на инструментот не го зачувува соодносот на хемиските форми. Во разредениот раствор во киветата повторно се воспоставува рамнотежа со поголем удел на мономер, па неговиот спектар правилно го опишува разредениот примерок, но погрешно го опишува основниот раствор. Пресметувањето на спектарот на основниот раствор наназад со зголемување на апсорбанците ја враќа процената за вкупната содржина само ако калибрацијата веќе го зема предвид поместувањето. Тоа никогаш не ја враќа првобитната форма на лентите. Секој што споредува спектар на концентрат со разреден референтен раствор споредува две различни смеси.

Должината на оптичкиот пат е дел од резултатот

Апсорбанцата се менува пропорционално со растојанието што светлината го минува низ примерокот. Кивета од 10 mm дава десетпати поголема апсорбанца од кивета од 1 mm што го содржи истиот раствор. Тоа пропорционално менување е точно само за истиот раствор, а агрегацијата го прави овој услов суштински важен.

Во практика, должината на патот е средство за останување во важечкиот опсег. Долг пат дава чувствителност за разредени, претежно мономерни раствори. Краток пат го задржува концентрираниот примерок во мерниот опсег без големо разредување што би ја променило рамнотежата. Истражувањето за агрегација од кое потекнуваат бројките наведени погоре го применило токму ова: кивети од 1 сантиметар за концентрации на бојата од 1.1 до 34 микромоларни и кивети од 0.01 сантиметар за концентрации од 94 микромоларни до 3.4 милимоларни. Мерните подлоги за микроволумени и читачите на микроплочи додаваат сопствена геометрија, со кратки и понекогаш променливи патишта, како и површини на кои катјонската боја може да се адсорбира. Наведете го патот заедно со бројката, исто како што спектралниот референтен преглед ги наведува растворувачот и солта. Апсорбанца без должина на оптичкиот пат не е резултат. Таа е гласина.

Дисциплината при мерењето произлегува од механизмот. Изедначете ги примероците на иста температура пред мерењето. Користете ист тип и иста ориентација на киветата, соодветни слепи проби со ист состав на соли и пуфер и чист лабораториски стаклен прибор, бидејќи метиленското сино се адсорбира на стакло и пластика, а обоена кивета задржува трага од последниот концентриран примерок. Мерете веднаш по подготовката кога е важна кинетиката на агрегација и изработете ја секоја калибрациска крива во истата матрица и со истата должина на оптичкиот пат како кај непознатите примероци. За визуелни проверки, запомнете дека окото е лош спектрометар. Дали бојата на растворот може да ја утврди чистотата е посебно прашање со негативен одговор, а поместувањата на нијансата поради агрегација се една од причините.

Дијаграм што треба да стои покрај инструментот

Сликата подолу ја сумира статијата во еден преглед за лабораториската маса. Три раствори ја содржат истата боја, но се разликуваат по вкупната концентрација и составот на соли во средината. Нивните шематски спектри покажуваат како мономерната лента на подолга бранова должина го губи својот удел во корист на димерната лента на пократка бранова должина со зголемувањето на слоевитото редење. Условите се наведени на сликата, бидејќи без нив кривите не можат повторно да се користат. За измерени положби на лентите под наведени услови, користете го спектралниот референтен преглед. За тоа како бојата навлегува во клетките откако ќе биде во раствор, видете навлегување во клетките преку редукција и распределба. За тоа како дозата на светлина и геометријата дополнително ги обликуваат фотохемиските мерења, видете изложување на светлина и геометрија на мерењето.

Правилото што треба да се запомни има два дела. Спектарот ја идентификува смесата присутна во киветата под наведените услови. Само калибрација изработена под истите тие услови ја претвора апсорбанцата во вкупна концентрација.