Може ли метиленското сино да го заобиколи митохондријалниот комплекс III? Зошто студиите не се согласуваат

Две лаборатории испитуваа дали метиленското сино може да заобиколи блокиран митохондријален комплекс III. Едната одговори не. Другата одговори да. И двете имаа податоци.

Првата студија, со митохондрии од мозок на глувци, утврди дека бојата не може да го заобиколи. Втората, со мозочни митохондрии од три вида глодачи, утврди дека делумно може. Трета студија, со црн дроб од глувци, често се цитира во истиот контекст, но испитувала нешто друго. Ако ја разгледуваме во соодветниот контекст, половина од забуната исчезнува.

Нема универзален механизам што може да се прогласи. Има три експерименти со различни блокатори, дози и мерени показатели. Прво прочитајте ги условите. Заклучоците произлегуваат од нив.

Што значи заобиколување во овој контекст

Електроните влегуваат во синџирот преку комплекс I (од NADH) или комплекс II (од сукцинат), поминуваат преку комплекс III до цитохром c, а потоа преку комплекс IV до кислородот. Градиентот што се создава по пат е она што клетката го користи за да создаде ATP.

Тврдењето за заобиколување подразбира дека метиленското сино презема електрони пред блокадата и ги предава по неа. Оксидираната боја презема електрони од NADH или од почетните компоненти на синџирот, претворајќи се во леукометиленско сино, а редуцираната форма ги предава на цитохром c или ги враќа во синџирот. Ако предавањето се случи по блокадата, респирацијата и мембранскиот потенцијал делумно се обновуваат. Ако се случи на местото на блокадата или пред неа, ништо не се обновува.

Еден детаљ на комплекс III е пресуден за голем дел од овој спор. Комплексот работи преку Q-циклус со две места за врзување на инхибитори. Антимицин се врзува за местото Qi. Миксотијазол се врзува за местото Qo. Студија што користи само еден од нив испитала само половина од комплексот.

Прва студија: нема заобиколување во митохондрии од мозок на глувци

Gureev и соработниците користеле митохондрии од мозочната кора на глувци C57BL/6, изолирани со дигитонин, испитувани при 0.1 mg протеин на ml. Супстратите опфаќале три режими: пируват и малат, секој по 5 mM, сукцинат при 10 mM со глутамат при 2 mM и L-пролин при 10 mM. Блокаторите биле ротенон при 1 micromolar (комплекс I) и антимицин при 1 microgram на ml (комплекс III). Дозите на бојата биле 0.5, 1 и 2 micromolar, со 1 micromolar како главна концентрација. Методите и записите од мерењата се во краткиот труд во FEBS Letters.

Заобиколувањето на комплекс I функционирало. Ротенон ја намалил респирацијата стимулирана со ADP од околу 121 на околу 2 nmol во минута на mg, а бојата при 1 micromolar ја обновила до околу 21. Мембранскиот потенцијал се обновил со пируват и малат и со L-пролин.

Заобиколувањето на комплекс III не функционирало. Антимицин ја намалил респирацијата на околу 16, а бојата ја зголемила само до околу 20. Мембранскиот потенцијал не се обновил со ниту еден супстрат, при дози на бојата до 5 micromolar. Податоците за пероксидот укажувале на истото: само бојата го зголемила ослободувањето на пероксид од базална стапка близу 76 pmol во минута на mg на приближно 1170, 1460 и 1945 при трите дози, но антимицин го намалил тој сигнал предизвикан од бојата за околу 25, 88 и 96 проценти, соодветно. Ако редуцираната боја реагирала директно со кислородот, блокирањето на комплекс III не би требало да го потисне сигналот. Авторите заклучиле дека редуцираната боја се оксидира на местото Qo на комплекс III, пред блокадата со антимицин. Кратката јамка, опишана со зборови: од донорите до бојата, од бојата до Qo, па понатаму по нормалниот пат. Ротенон се заобиколува. Антимицин не се заобиколува.

Втора студија: делумно заобиколување кај три вида, на двете места за инхибитори

Svab и соработниците го прошириле експерименталниот дизајн. Користеле мозочни митохондрии од глувци, стаорци и заморчиња, изолирани со Percoll, испитувани при истите 0.1 mg на ml, со пируват и малат или глутамат и малат, секој по 5 mM. Користеле два блокатора на комплекс III: антимицин A при 0.3 micromolar и миксотијазол при 1 micromolar. Бојата била при 2 micromolar во повеќето испитувања, а при 0.5 во испитувањата со цитохром c. Сите три вида, со усогласени протоколи, се опфатени во трудот со отворен пристап.

Двете блокади биле делумно заобиколени кај сите три вида. Во митохондриите од глувци, антимицин ја потиснал респирацијата, а бојата ја зголемила за околу 60 проценти, од приближно 37 на 59 nmol во минута на mg. Миксотијазол ја потиснал за 88 проценти, на околу 4.5, а бојата ја зголемила петкратно, на околу 23. Мембраната делумно се реполаризирала при двата инхибитора, што било измерено со две бои (сафранин O и ратиометриски TMRM) за да се исклучат оптички артефакти.

Овој труд директно го испитал и предавањето на електроните, нешто што првата студија воопшто не го направила. Егзогениот ацетилиран цитохром c при 25 micromolar не бил редуциран од енергизираните митохондрии, со или без инхибитори, но додавањето боја предизвикало редукција во двата случаја. Во пуфер без клетки, NADH со боја го редуцирал цитохром c со стапка пропорционална на NADH. Подолгиот скок, опишан со зборови: редукциските еквиваленти до бојата, бојата директно до цитохром c, комплекс IV до кислородот. Тој пат целосно го прескокнува комплекс III, па двата блокатора може да се заобиколат.

Два дополнителни мерени показатели го поткрепуваат тоа толкување. Флуоресценцијата на NAD(P)H се намалила кога била додадена боја во митохондрии третирани со миксотијазол, што значи дека редукциските еквиваленти се одведувале преку новиот пат. И апсорбанцата на бојата при 660 nm се менувала со секое последователно додавање, додека супернатантите по центрифугирање покажале дека оксидираната боја се концентрирала во енергизираните митохондрии над стократно, а потоа ги напуштала кога потенцијалот се губел. И протонскиот биланс се совпаѓа: прескокнувањето на чекорите на пумпање остава приближно 2 протони по електронски пар наместо 10, па побрзото користење кислород со само делумна реполаризација е она што се очекува при вистинско заобиколување, а не доказ против него.

Истиот препарат дал одговори што лесно водат до погрешни заклучоци при површно читање. Во присуство на инхибитор и боја, ADP ја намалил респирацијата наместо да ја зголеми, а блокадата на транспортот ја стимулирала наместо да ја забави, додека мембранскиот потенцијал и понатаму се менувал во вообичаените насоки. Самата потрошувачка на кислород може да наведе на погрешен заклучок во овој систем.

Трета студија: студијата со црн дроб што ги испитувала комплексите I и II, а не III

Lee и Boelsterli користеле митохондрии од црн дроб на глувци и култивирани хепатоцити оштетени со ефавиренз (комплекс I, IC50 близу 30 micromolar) и хидразин, метаболитот на изонијазид (комплекс II, IC50 близу 30 micromolar). Бојата при околу 30 micromolar ги обновила оксидацијата на NADH, мембранскиот потенцијал и ATP, истовремено намалувајќи ги оксидансите и некротичната смрт. Трудот во Redox Biology го моделира ова како пренесување електрони со бојата околу оштетените комплекси I и II.

Тој резултат е утврден контекст за претходните делови од синџирот и не кажува ништо за комплекс III, бидејќи таму ништо не било блокирано. Не може да потврди ниту да побие ниту една од двете студии со мозочни митохондрии.

Матрица на условите

Четири причини зошто двете студии за комплекс III може да бидат точни за сопствените експериментални услови

1. Блокаторот не бил истата интервенција. Само антимицин при 1 microgram на ml наспроти антимицин при 0.3 micromolar и одделен блокатор на местото Qo. Патот преку бојата што ги внесува електроните во местото Qo не успева токму таму каде што успева директниот пат до цитохром c. Едно место не може да ги претставува двете.

2. Дозата на бојата и временската рамка се разликувале. Главни концентрации од 1 наспроти 2 micromolar, кај супстанција што учествува во редокс-циклуси и чие преземање и директна редукција на цитохром c зависат од концентрацијата и времето. Малите разлики во дозата, заедно со различното време на мерење, може да откријат различни делови од иста мрежа.

3. Препаратите се разликувале. Изолацијата со дигитонин наспроти изолацијата со градиент на Percoll избира митохондријални популации што се преклопуваат, но не се идентични. Концентрацијата на протеин била усогласена на 0.1 mg на ml, па таа променлива се исклучува, но не и субпопулацијата и интегритетот. А сомнежот дека причината е видот бил отфрлен: втората група го репродуцирала својот фенотип и кај глувци.

4. Супстратните услови одредуваат што може да направи бојата. Три супстратни режими наспроти парови поврзани со NADH. Достапноста на NADH и мембранскиот потенцијал заедно одредуваат колку брзо се редуцира бојата и каде се распределува, а патот што бара редуцирана боја покрај оксидиран цитохром c зависи од тој избор.

Како да го прочитате следното тврдење за заобиколување

Прашајте кој комплекс бил блокиран, со кој инхибитор, на кое место и при која доза. Прашајте за концентрацијата на бојата и кога било извршено мерењето. Прашајте за ткивото, видот, изолацијата, концентрацијата на протеин и супстратот. И прашајте дали потенцијалот, респирацијата, редокс-состојбата и директното испитување на предавањето електрони се согласуваат, бидејќи тука самата потрошувачка на кислород повеќепати наведувала на погрешен заклучок.

Тесно формулираното резиме останува валидно. За заобиколувањето на комплекс I со бојата постои согласност. Кај комплекс III, митохондриите од глувци со антимицин при 1 microgram на ml и боја при 1 micromolar не покажуваат функционално заобиколување, додека три вида со антимицин при 0.3 micromolar или миксотијазол при 1 micromolar и боја при 2 micromolar покажуваат делумно заобиколување со директен пренос од бојата до цитохром c. Тие реченици можат да важат истовремено. Сè пошироко од тоа е екстраполација.

Поврзаните текстови го задржуваат спорното тврдење во рамките на неспорната хемија: како метиленското сино пренесува електрони за преносот, експериментите за заобиколување на комплекс I за утврдениот случај во претходниот дел од синџирот, мерењата на мембранскиот потенцијал и нивните артефакти за тоа зошто биле потребни две бои и лабораториското ракување со супстанции што учествуваат во редокс-циклуси за замките поврзани со дозирањето и временската рамка.