Метиленско сино и фероптоза: железо, липидна пероксидација и клеточна смрт

Фероптозата е клеточна смрт предизвикана од оштетување на мембраната. Полинезаситените масти во мембраните оксидираат во верижна реакција, мембраната ја губи својата функција и клетката умира. За оваа хемиска реакција е неопходно железо. Таа реченица го опфаќа целиот концепт, а сè во оваа статија претставува испитување на еден негов дел.

Прашањето тука е потесно: како метиленското сино влијае врз тој синџир во експериментите со клетки и што навистина покажува тој резултат. Краткиот одговор е дека во две лабораториски студии, метиленското сино во наномоларни концентрации ја намалило митохондријалната липидна пероксидација и ги одржало клетките живи по дејство на предизвикувачи кои инаку предизвикуваат фероптоза. Подолгиот одговор е поважен, бидејќи секоја алка во синџирот била испитана со различна интервенција, а секоја интервенција има ограничувања.

Фероптозата во еден пасус

Мембранскиот фосфолипид што носи опашка од полинезаситена масна киселина има слаба точка: водородни атоми што лесно се одземаат. Кога радикал ќе одземе еден од нив, кислородот се врзува за липидот, се формира липиден пероксилен радикал, а тој радикал одзема водород од следниот липид. Реакцијата се шири долж мембраната, освен ако нешто не ја запре.

Главниот механизам за запирање е ензим наречен GPX4, кој користи глутатион за да ги редуцира липидните пероксиди во безопасни липидни алкохоли. Лабораториските предизвикувачи ја напаѓаат оваа одбрана на точно определени места. Ерастин го блокира внесувањето цистин преку системот xc-минус, со што ја лишува клетката од цистеин потребен за синтеза на глутатион. Бутионин сулфоксимин директно ја блокира синтезата на глутатион. RSL3 го инхибира самиот GPX4. Сите три ги оставаат пероксидите неотстранети, но тоа го прават во различни чекори, па резултатот со еден предизвикувач не може автоматски да се примени на другите.

Фероптозата се разликува од апоптозата според својствата што ја дефинираат. Нема каспазна каскада ниту апоптотични тела. Хелаторите на железо, како дефероксамин, и средствата што ги заробуваат радикалите, како феростатин-1, ја потиснуваат. Тоа е практичниот тест што истражувачите го користат за да ја означат смртта како фероптотична, а не само како некротична. Поширокиот преглед на патиштата на регулирана клеточна смрт ја става оваа разлика во контекст, а начинот на кој клетките управуваат со лабилното железо објаснува зошто хелацијата е толку пресудна контролна постапка.

Каде се вклопуваат митохондриите и зошто тоа било спорно

Раните истражувања покажале дека клетките без митохондријална ДНК сепак подлежат на фероптоза, што укажувало дека митохондриите не се неопходни. Подоцнежните истражувања откриле дека отстранувањето на митохондриите или блокирањето на респирацијата може да ја потисне фероптозата предизвикана од недостиг на цистеин, но не и онаа предизвикана од директна инхибиција на GPX4. Двата резултата можат да бидат точни ако придонесот на митохондриите зависи од предизвикувачот, типот на клетката и местото каде што се одвива пресудната пероксидација.

Студијата врз која се темели оваа статија го разгледала спорот со сонда специфична за одреден клеточен компартмент. MitoCLox е верзија на индикатор за липидна пероксидација насочена кон митохондриите: ја менува флуоресценцијата кога ќе наиде на липидни пероксилни радикали во митохондриите. Во фибробластите третирани со ерастин, оксидацијата на митохондријалната сонда се појавила во сè уште живи клетки, пред нивната смрт, и се разликувала меѓу клетките во популацијата. Временскиот редослед е важен. Пероксидацијата што ѝ претходи на смртта е можна причина. Пероксидацијата измерена само во мртви клетки е остаток од распаѓањето. Придружниот водич за тестови за липидна пероксидација и што покажува секоја сонда објаснува зошто локацијата на сондата го одредува значењето на сигналот.

Истата шема се појавила и во втор модел. Фибробластите од пациент со Леберова наследна оптичка невропатија, кои носат мутација во комплекс I и имаат повисок основен оксидативен стрес, умирале преку фероптоза кога глутатионот бил исцрпен, додека контролните фибробласти биле отпорни. Оксидацијата на митохондријалната сонда повторно се појавила прва. Деталите се во студијата со фибробласти за митохондријалната липидна пероксидација при фероптоза.

Што променило метиленското сино во овие експерименти

Метиленското сино е редокс-преносител. Неговата оксидирана форма прима електрони од хемиските реакции поврзани со NADH кај комплекс I, а неговата редуцирана форма ги предава на цитохром c, кој го снабдува комплекс IV со електрони. Тоа создава делумно заобиколување на сегментот од синџирот каде што електроните вообичаено се одлеваат кон кислородот, создавајќи супероксид. Читателите што сакаат целосна слика за преносот треба да почнат со како метиленското сино пренесува електрони низ митохондриите.

Во белодробните фибробласти третирани со ерастин, метиленското сино во концентрација од 250 наномоли на литар ја зачувало вијабилноста според мерењето на клеточното преживување, како и антиоксидансите SkQ1 и MitoTEMPO насочени кон митохондриите. Контролите го определуваат опсегот на заклучокот. Феростатин-1, алфа-токоферол и дефероксамин исто така обезбедиле заштита, што потврдува дека смртта била фероптотична. Аналогот на SkQ1 без антиоксидантна група не обезбедил заштита, што упатува на редокс-хемија, а не на неспецифично натрупување. Заштитата ослабувала над приближно 200 наномоли на литар SkQ1, што е во согласност со познатото прооксидантно однесување на хинонските антиоксиданси при повисоки концентрации. Метиленското сино го има истото двојно однесување во зависност од дозата: во овие садови за клеточни култури било заштитно при ниски наномоларни концентрации, но може да создава водороден пероксид преку редокс-циклирање при повисоки концентрации или силно осветлување. Ваквиот контекст на дозата е обработен во реактивни кислородни видови во митохондриите.

Експериментите со изолирани митохондрии потоа ги разграничиле изворите на ROS. Во присуство на двовалентно железо, супстратите што го снабдуваат комплекс I, заедно со ротенон, ја поттикнале оксидацијата на сондата. Ротенон го блокира преносот по флавинското место, па преносителите пред блокадата остануваат редуцирани и од флавинот свртен кон матриксот одлеваат електрони кон кислородот. Супстратите што го снабдуваат комплекс III, заедно со антимицин A, создале изобилство водороден пероксид, но не предизвикале липидна пероксидација. Ист вкупен сигнал за ROS, различна локација, различен исход. И SkQ1 и метиленското сино ја потиснале пероксидацијата поттикната од комплекс I без да го потиснат самото создавање водороден пероксид, што го сместува нивното дејство по формирањето на ROS, во чекорот на липидна пероксидација.

Експериментите со преоптоварување со железо и трагата од липофусцинот

Втората студија го разгледала прашањето од аспект на железото. Кардиомиоцитите H9c2 изложени на субмилимоларни концентрации на железо(III) амониум цитрат развиле митохондријални ROS, митохондријална липидна пероксидација, а потоа фероптоза, проследена со натрупување пигмент сличен на липофусцин во рок од 24 часа. Липофусцинот е автофлуоресцентен остаток од оксидирани липиди и протеини што содржи железо и се натрупува со возраста. Неговата брза појава тука ја поврзува акутната пероксидација поттикната од железо со класичен маркер на стареење. И метиленското сино во наномоларни концентрации и SkQ1 ги спречиле пероксидацијата, смртта и натрупувањето на пигментот. Изолираните срцеви митохондрии ја потврдиле шемата: ротенон со двовалентно железо предизвикал пероксидација и сигнал сличен на пигмент, а двете средства го блокирале тоа. Целиот редослед е опишан во студијата за преоптоварување со железо во кардиомиоцити H9c2. Аспектот со пигментот е поврзан со липофусцинот и маркерите на клеточно стареење.

Што не покажуваат тестовите за клеточно преживување

Мерењето на вијабилноста со метод како CellTiterBlue покажува колку клетки во садот остануваат метаболички активни по дејството на предизвикувач и потенцијално заштитно средство. Тоа е тест на механизам во дефиниран систем. Не е исход од лекување. Ниту еден од овие експерименти не вклучувал давање доза на пациент, мерење краен показател за болест или утврдување терапевтски прозорец во организам.

Четири ограничувања заслужуваат да бидат јасно наведени. Прво, опфатени се мал број типови клетки: трансформирани белодробни фибробласти, примарни кожни фибробласти, вклучително и една линија со митохондријална болест, и линија на кардиомиоцити од стаорец, како и изолирани митохондрии од срце на стаорец. Чувствителноста се разликувала меѓу линиите, а линијата со LHON била намерно избрана како невообичаено ранлива. Второ, предизвикувачите се лабораториски екстреми: целосна блокада на транспортот или на синтезата и оптоварувања со железо на кои ниту едно ткиво не би било акутно изложено. Трето, концентрацијата не може да се претвори во доза со едноставно множење. Наномоларната концентрација во медиум за клеточна култура не е доза за човек, а распределбата на метиленското сино, неговата редукција во безбојна форма во крвта и ткивата, изложеноста на светлина и мембранскиот потенцијал се фактори што го одделуваат садот со култура од човекот. Четврто, сондите даваат информации за сопствениот компартмент. Оксидацијата на MitoCLox покажува дека се формирале митохондријални липидни радикали; таа не покажува дали пукањето на плазматската мембрана, веројатниот завршен настан, било директно спречено или избегнато преку дејство во претходните чекори.

Затоа, оправданиот заклучок е следниов: во овие модели, ROS што потекнуваат од комплекс I заедно со железото предизвикуваат митохондријална липидна пероксидација што ѝ претходи на фероптозата, а метиленското сино при ниски концентрации го прекинува тој сегмент. За сè што оди подалеку од тој сегмент се потребни поинакви експерименти кај животни, а потоа и кај луѓе.